众所周知，蛋白聚集是许多神经退行性疾病的常见的病理机制。肌萎缩侧索硬化（ALS）和额颞叶痴呆（FTLD）就存在多种RNA结合蛋白形成的病理包涵体，这些蛋白包括FUS、TDP-43、TIA1、TAF15、EWSR1和hnRNPA1。它们具有内在无序区域（IDR），可促进聚集并常常富含精氨酸和甘氨酸的重复序列。此外，它们结合RNA，促进相分离的冷凝物的形成。一旦形成，冷凝物就可以转化为纤维状固体，类似于在尸检ALS / FTLD神经元时观察到的病理包涵体。FUS就是这样一种高度无序的蛋白质，并已被证实可以进行液-液相分离（LLPS）。一些生物大分子（例如蛋白质和核酸）可以通过LLPS凝聚成类似液体的无膜冷凝物，形成细胞内的无膜隔室，参与各种生物学活动。FUS不论与同型的FUS还是RNA相互作用都可以形成LLPS。

2020年12月17日，美国约翰霍普金斯大学SuaMyong团队在Molecular Cell 上发表了题为“ALS/FTLD-LinkedMutations in FUS Glycine Residues Cause Accelerated Gelation and ReducedInteractions with Wild-Type FUS”的文章，该研究表明甘氨酸突变导致的FUS加速凝胶化可能是FUS介导ALS / FTLD发病的重要机制，同时与野生型（WT）FUS蛋白缺乏物理联系可能会导致更严重的病理。

该研究主要围绕WT FUS对突变FUS与RNA结合、寡聚以及冷凝物形成和融合的影响展开，重点回答了四个基本问题：（1）WT和突变FUS是否可以通过相互作用形成具有RNA骨架的混合冷凝物？（2）WT和突变 FUS分别在哪个阶段相互结合和分离？（3）WT和突变FUS的RNA结合表型是什么？（4）随着突变FUS的成熟，这种相互作用如何变化？

研究证明甘氨酸（G）突变在FUS-RNA成核和冷凝物形成的最早阶段就开始与WT FUS失去关联；而精氨酸（R）突变体在所有阶段都与WT存在物理相互作用，促进了R突变缺陷的恢复。如果将WT FUS添加到老化的突变FUS冷凝物中，这种恢复效果会降低

主要结果：

图1. FUS中的甘氨酸突变导致冷凝物分离

（一）G突变和WTFUS分别形成独立的冷凝物

为了测试WT和突变FUS是否聚在一起形成相分离的液滴，在液滴形成条件下将等摩尔比的Cy3-和Cy5- FUS合并在一起。结果表明，将RNA和Cy3-WT和Cy5-WT FUS混合可以观察到混合液滴的形成，Cy5标记的R244C突变也可以与Cy3-WTFUS有效混合。然而，Cy5-G156E突变不容易与Cy3-WT混合，大多形成独立的液滴。（图1）

（二）WT FUS和G突变无法与同一RNA结合

该研究团队开发了一种单分子双色成核测定法，其中通过全内反射（TIRF）显微镜实时观察了彩色编码的WT和突变FUS在RNA骨架上的结合。通过生物素-NeutrAvidin的连接将未标记的部分双链U50 RNA束缚在单分子表面，并在记录单分子视频的同时流入TEV裂解的Cy3和/或Cy5标记的FUS混合物。随着颜色编码的FUS的单个分子与RNA结合，荧光强度以逐步的方式增加。结果表明，G突变和WT FUS的混合物比其他混合物表现出更高的荧光强度，这提示G突变 FUS与WT FUS无法产生相互作用。

图2. G156E -FUS的功能缺陷无法被WT FUS恢复

（三）WT FUS无法代偿G突变 FUS的功能缺陷    

在RNA-FUS相互作用中，R突变的FUS可与WT FUS结合，代偿其由于突变所致的部分功能缺陷。而G突变的FUS因与WT FUS无法互作，所以因突变导致的功能缺陷无法恢复。（图2）

图3. 突变FUS捕获进入突变凝析物的新的WT FUS

（四）老化的突变FUS影响WT FUS功能   

为了评估突变FUS老化后与WTFUS的相互作用，该研究团队将预先老化3小时的Cy5突变FUS与Cy3-WT FUS混合在一起。对照组Cy5-WT和Cy3-WT快速结合，在10-20分钟内形成混合液滴。老化的Cy5-G156E与Cy3-WT仍未发生结合。将Cy3-WT加入到老化的Cy5-R244C中1小时后两者逐渐混合，这比WT-WT混合所需时间略长一些。（图3）

总结：

ALS/FTLD相关的FUS变异是如何通过改变相互作用引起疾病发作的呢？尽管一些pull-down研究并未发现WT FUS和突变FUS的相互作用，可是RNA代谢比如剪接作用会受到FUS突变的影响。目前发现的ALS/FTLD患者神经元的两个常见的病理特征是FUS与其他RNA结合蛋白的聚集和错误定位。该团队通过对FUS 3个甘氨酸残基的点突变的研究，为ALS/FTLD的发病机制提供了新思路，即突变FUS可以改变蛋白的性质并且能够对WT FUS产生排斥。然而，ALS/FTLD是如何在细胞中进展的呢？这可能需要进一步研究突变FUS与RNA的结合是如何调控细胞中FUS的液-液相分离的，这也将有助于发现干预突变FUS凝胶化的靶点。

Tags： Mol Cell ：肌萎缩侧索硬化和额颞叶痴呆发病新机制