自女性青春期起，在卵巢分泌的雌激素和孕激素的周期性作用下，子宫内膜功能层出现周期性变化，每28天左右发生一次内膜的剥脱与出血继之修复和增生的过程，称为月经周期（图1）。子宫内膜是孕育生命的土壤，内膜过薄，就像盐碱地，寸草不生；内膜过厚，就像是沼泽地，寸步难行。子宫内膜能否达到一定厚度以及对胚胎容受性是怀孕的关键，因此子宫内膜状态检测对受孕至关重要。

图1 月经周期中卵巢、子宫内膜、体温和荷尔蒙变化（图源：wikiwand）

人类辅助生殖技术（Assisted Reproductive Technology，ART）可实现部分生育能力受限但有生育需求人群的生育目标。事实上，只有35%的胚胎移植 （Embryo transfers，ET）会被确认为临床妊娠。就如备孕需要在排卵期进行一样，要提高胚胎植入率，就需要先知道子宫内膜是否已为ET做好了准备。由于子宫内膜的周期性变化，在进行胚胎移植前，需要准备子宫内膜：通过顺序给药以类似于自然周期的方式刺激子宫内膜的生长，即雌激素增厚，孕激素打开移植窗口。子宫内膜与移植胚胎之间的相互作用受到两个关键因素的影响：子宫内膜容受性和胚胎发育阶段与植入窗口期间子宫内膜轮廓之间的同步。

子宫内膜活检是一种侵入性检测子宫内膜状态的方法。但是，由于担心活检影响子宫内膜，继而影响胚胎植入，ET不会在活检取样的同一周期进行。因此，如果活检显示子宫内膜是容受性的，结果使用将递推至下一周期。事实上，这种假设是不现实的，因为子宫内膜周期是一个动态过程，涉及许多影响子宫内膜容受性的因素。因此，需要寻找非侵入性工具来检测执行ET的最佳时间。

2022年10月，西班牙巴斯克大学研究团队在Human reproduction发表题为“microRNA-based signatures obtained from endometrial fluid identify implantative endometrium”的研究成果（图2）[1]。研究结果表明使用来自人类子宫内膜液样本的游离miRNA和细胞外囊泡相关的miRNA可以非侵入性方式检测子宫内膜状态。

图2 研究成果（图源：[1]）

在这项前瞻性研究中，研究人员纳入162名在克鲁塞斯大学医院人类生殖科就医的女性患者，并将其分为三组：（1）Setup pool队列：收集72名女性在自然月经周期的月经后16-21天子宫内膜液（Endometrial fluid，EF）；（2）发现队列：收集30名女性在接受冷冻胚胎移植前的EF。其中15名女性植入成功，15名女性植入失败；（3）验证队列：收集60名女性在接受冷冻胚胎移植前的EF。其中30名女性成功怀孕，并纳入植入子宫内膜组，其他30名纳入非植入组。

图3 样本分析设计（图源：[1]）

此项研究旨在探索EF游离miRNA和细胞外囊泡（Extracellular vesicle，EV）miRNA特征来识别子宫内膜的状态。研究比较了五种不同的RNA提取方法；其中两种方法基于直接提取RNA，另外三种方法在提取RNA之前采用EV富集步骤；通过进行miRNA测序以确定最有效的检测方法，并找到区分植入子宫内膜和非植入子宫内膜的预测模型；在两组具有不同植入结果的样本（发现和验证队列）中使用定量PCR对模型进行了确认。

研究发现：

01 从五种提取miRNA的方法中找到两种效果最好的方法

研究使用了五种miRNA提取方法：DCT-M、DCT-N、PBP-M、PBP-N和UC-M。通过对miRNA分析发现PBP（PBP-N和PBP-M）进行EV富集步骤的方法比其他方法表现更好，其中PBP-N是最有效的方法（图4）。

图4 优化分析子宫内膜液中miRNA的不同方法（图源：[1]）

 

02 通过分析样本miRNA，找出两种可预测EF状态的模型

通过对发现组中差异表达的miRNA的标准化qPCR数据进行自举校正进行回归研究，选择出两个效果较好的预测模型：PBP-M模型基于三种miRNA（hsa-miR-24-3p、hsa-miR-200b-3p和hsa-miR-148b-3p），对符合给定特征的数据具有鲁棒性；PBP-N模型则基于三种miRNA（hsa-miR-24-3p、hsa-miR-200b-3p和hsa-miR-99b-5p）。与随机机会结果相比，这两种模型都具有显著的预测性。通过分析其预测的靶基因，这些miRNA的调节功能与胚胎植入和子宫内膜蜕膜密切相关。

图5 PBP-M和PBP-N的分析性能（图源：[1]）

 

03 通过对miRNA分析模型的验证，发现其能够检测子宫内膜状态 

PBP-M和PBP-N分析模型预测子宫内膜可植入状态的性能在独立队列中得到验证：PBP-M的准确度为0.68，且hsa-miR-148b-3p是区分植入性和非植入性子宫内膜的最可能变量；PBP-N的准确度为0.77，且hsa-miR-99b-5p是区分非植入性子宫内膜和植入性子宫内膜的最有效变量。

此项研究引用的术语“植入性子宫内膜”用来表示子宫内膜的胚胎植入与EF抽吸在同一周期内成功完成。通过优化EF游离miRNA和细胞外囊泡miRNA的提取，研究发现基于PBP的EV富集技术（PBP-M和PBP-N）提高了EF样本中miRNA检测的效率；PBP-N在对miRNA分析的优化过程中提供了最佳预测结果，且具有可重复、过程简化的特点，其在两个独立队列中的应用显示出一致的结果。

此项研究的限制在于参与试验的女性和移植的胚胎的固有可变性。当ET植入失败时，不能假设问题仅与子宫内膜有关，因为问题可能出在胚胎、子宫内膜或两者兼而有之；另一个限制是测序数据与人类基因组的比对率变化很大，这表明样本之间存在很大差异。

PBP-N可用于使用基于miRNA的非侵入性工具评估子宫内膜能力。因此，辅助生殖中心的专业人员可以使用hsa-miR-99b-5p来预测子宫内膜状态。这可能不仅有助于提高接受ART女性的胚胎植入成功率，还可以减少胚胎损失。

参考资料：

[1]Ibañez-Perez J, Díaz-Nuñez M, Clos-García M, et al. microRNA-based signatures obtained from endometrial fluid identify implantative endometrium. Hum Reprod. 2022 Sep 30;37(10):2375-2391. doi: 10.1093/humrep/deac184. PMID: 36029522; PMCID: PMC9527456. 

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