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导读
长期以来，肝病研究始终面临一个核心难题：如何在体外尽可能真实地保留人类肝脏的复杂结构与细胞互作。传统二维细胞培养虽然操作简便，但难以再现肝脏微环境；动物模型虽可模拟部分病理过程，却存在明显的物种差异。近年来兴起的类器官和器官芯片技术虽然前景广阔，但仍难以充分保留真实人类肝组织中的免疫细胞、基质细胞、胆管系统及空间结构。
近日，来自美国哈佛医学院的Z Gordon Jiang教授及团队在eGastroenterology发表了题为“Extended precision cut liver slice culture models liver regeneration and ductular reaction”的研究简讯，本研究报道了一种经过系统优化的人类精密肝组织切片（precision-cut liver slice, PCLS）长时程培养体系，可将人类肝组织切片的可存活培养时间延长至2周，为肝脏再生、纤维化及胆管反应等关键病理过程研究提供了更接近真实人体组织环境的模型。
一、为什么“肝组织切片”如此重要？
PCLS技术并非全新概念，其基础早在40多年前就已随着Krumdieck组织切片仪的发明而奠定。 然而，过去几十年中，这一技术始终未能广泛普及，原因主要包括：
难以获得可用于研究的高质量人类肝组织；
切片制备与质量控制存在技术挑战；
组织培养寿命过短；
活性评估方法存在局限；
不同实验室之间的重复性仍有待提高。
研究团队指出，既往综述显示，仅约30%的相关研究使用人类肝组织，而能够将培养时间维持超过72小时的研究甚至不足7%。这意味着，既往绝大多数PCLS研究更多局限于短期反应观察，难以充分研究慢性肝病中的组织重塑、纤维化进展以及再生过程。而本研究的重要进展之一，就是较系统地建立并验证了可支持人类PCLS长时程培养的优化体系，将可存活培养时间延长至2周。
二、可稳定维持两周的人类PCLS长时程培养体系
研究团队对传统PCLS流程进行了多环节优化（见图1）。
1. 离体肝脏资源的有效利用
研究使用了25例人类离体肝脏标本，来源涵盖多种肝脏疾病或组织背景，包括：酒精相关性肝病（alcohol-associated liver disease, ALD）、酒精相关性肝炎（alcohol-associated hepatitis, AH）、代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（metabolic dysfunction associated steatohepatitis, MASH）、原发性硬化性胆管炎（primary sclerosing cholangitis, PSC)、HBV相关肝病、移植失败相关肝脏、以及多囊肝病或转移癌患者肝脏中的相对正常肝组织等。
这一策略具有现实意义：传统研究中，健康人类肝组织极难获取，而离体肝脏不仅可为PCLS制备提供较为丰富的组织来源，还能够较真实地反映终末期肝病状态，为疾病机制研究提供天然优势。与此同时，多囊肝病或局灶性病变周围的相对正常组织，则可作为“近正常对照”。这意味着，这一体系未来有潜力建立覆盖不同病因、不同组织病理背景的人类肝病模型资源。
图1：优化的人类PCLS长时程培养体系。(A) 优化后的PCLS制备与培养流程示意图；(B) 25例供体肝脏的疾病背景及实验结局分布；(C) 早期培养失败与成功长时程培养的代表性全板成像；(D) 存活细胞与死亡细胞双染评估PCLS组织活性，其中绿色代表存活细胞，红色代表死亡细胞，蓝色代表细胞核；(E) Seahorse检测不同来源PCLS在延长培养过程中的基础氧耗率变化，提示存在动态代谢重塑。
2. 压缩辅助式振动切片机提升切片质量
研究团队采用了压缩辅助式振动切片机技术进行切片。传统切片过程中，肝组织质地柔软且富含脂质，容易发生边缘撕裂、厚度不均、局部坏死以及氧弥散不均。而压缩辅助切片有助于提高组织稳定性，使切片更加均匀，从而改善后续培养的存活率和重复性。这类工程化优化虽然容易被忽视，但实际上是PCLS长期培养能否成功的关键基础。
3. 优化氧供与恢复阶段
研究团队在切片后设置了高氧恢复阶段，并持续优化氧气和营养供应。其原因是，PCLS一旦离开人体循环系统，原有正常血液循环和胆汁引流均会消失。组织只能依赖被动扩散获得氧气、营养物质和代谢物交换，因此容易承受缺氧与代谢压力。
研究发现，不同来源肝组织在培养中的代谢轨迹存在显著差异：
健康来源PCLS氧耗率随时间下降；
肝硬化来源PCLS的氧耗率则随时间升高。
这提示不同疾病背景的肝组织在延长培养过程中可能经历不同形式的细胞重塑与应激反应。
三、系统捕捉人类肝组织的“动态重塑过程”
与传统“静态组织培养”不同，研究团队发现：PCLS并非只是“被保存”的组织，而是在延长培养过程中会发生持续、动态的病理重塑。
1. 肝细胞会逐渐“失去身份”
研究显示，在培养早期：（1）肝细胞逐渐脱离基底膜；（2）细胞连接可能受到破坏；（3）培养液中白蛋白水平下降；（4）组织学上可见偶发性细胞核丢失，并出现肝细胞应激和去分化现象。这种过程并不一定意味着细胞死亡，而更像是一种应激状态下的细胞身份重塑。
越来越多的研究认为，慢性肝病进展过程中，肝细胞身份丧失可能是推动肝硬化和AH的重要机制，延长PCLS培养体系使研究人员能够在更接近真实人类组织环境的模型中，对这些关键病理过程进行动态观察和实验验证。
2. 纤维化会在体外培养过程中形成
研究进一步发现，来源于健康肝脏的PCLS在培养后数天内即可出现门脉区纤维化，甚至最早可在第7天进展为桥接纤维化。这一现象提示：即使脱离人体循环环境，肝组织在离体培养条件下仍可启动并推进纤维化相关程序。
更重要的是，这一过程涉及肝细胞、成纤维细胞、免疫细胞、胆管细胞等多细胞协同反应，而这正是传统单细胞模型难以实现的。
3. 再生与胆管反应首次被同步观察
研究还发现，在健康来源PCLS中，出现了缺乏基底膜的肝细胞集落，提示肝细胞发生再生。而在肝硬化来源的PCLS中，则逐渐出现KRT19阳性细胞，而KRT19是胆管上皮细胞和肝祖细胞的重要标志物，这提示肝硬化组织在培养过程中可形成胆管反应。
近年来，胆管反应被认为与肝纤维化进展、肝再生失衡以及慢性炎症维持密切相关。然而，由于缺乏合适的人类组织模型，相关机制研究进展缓慢。本研究在优化的人类PCLS长时程培养体系中重现了这一过程。
四、建立多维度活性评估体系
除了培养体系本身的优化，本研究还建立了多维度组织活性监测框架。传统PCLS研究多依赖ATP检测评估组织活性，但需要破坏样本、难以实现连续监测，且缺乏空间信息。因此，研究团队构建了三重评估体系：
全板实时成像：用于每日动态观察组织形态变化，使研究者能够在早期识别培养失败样本。
存活细胞与死亡细胞双染：通过对完整组织切片进行染色，同时显示存活细胞和死亡细胞，并保留组织空间结构信息。
Seahorse代谢分析：研究采用Seahorse技术检测氧耗率，从代谢层面量化组织活性。相比传统终点检测，这种多维度评估框架更适合支持长时程动态研究以及不同疾病状态下PCLS模型的比较。
五、为什么这项研究具有重要转化潜力？
PCLS最大的优势，在于其保留了较完整的“人类原位组织特征”。与动物模型相比，它来源于人类组织，能够保留人类特异性代谢、真实免疫微环境、原位细胞互作和疾病相关空间结构。因此，这一模型未来可能在多个方向产生重要影响。
1. 新药筛选平台
目前，大量抗纤维化药物在动物实验中表现良好，但进入临床后缺屡屡失败。其核心原因之一，是动物模型难以完全反映人类肝病的复杂情况。而PCLS则有潜力成为一个重要的人类来源验证平台，适用于抗纤维化药物、抗炎治疗、促进再生药物以及胆管反应干预策略的评估。尤其是，该体系能够在同一组织环境中同时观察肝细胞变化、免疫相关反应、纤维化进展和胆管反应等复杂过程。
2. 个体化精准医学研究模型
由于PCLS直接来源于患者组织，因此未来有潜力应用于患者特异性药敏测试、个体化治疗预测、不同病因肝病比较，以及多组学整合分析。在此基础上，这一体系有望进一步构建“患者肝组织数字孪生系统”。
3. 替代动物实验的新方法学
研究开篇特别强调，美国NIH正在推动“新方法学”（New Approach Methodologies, NAMs）发展。PCLS正是NAMs的重要代表。随着监管领域越来越强调减少动物实验、提升模型的人类相关性并增强药物预测准确性，PCLS有望在未来肝病机制研究、药物研发和毒理学研究中发挥更加重要的作用。
六、结语
过去，人们更多将PCLS视为一种“组织保存技术”。但这项研究表明，经过系统优化的人类PCLS长时程培养体系能够模拟人类肝病中的动态病理过程。PCLS不仅能够保留肝脏微结构，更能够重现应激状态下的多细胞协调应答，而这正是人类慢性肝病的重要特征。
随着空间组学、单细胞测序、AI病理分析以及多组学整合的发展，PCLS未来有望成为连接基础机制研究、转化医学、药物开发与精准治疗的重要桥梁。对于长期缺乏高质量人类模型的肝病研究领域而言，这项工作或许代表着一种新的研究范式正在逐步形成。
引证本文
Izunza Barba S, Rubio-Cruz D, Naz S, et al. Extended precision cut liver slice culture models liver regeneration and ductular reaction. eGastroenterology 2026;4:e100389.
https://egastroenterology.bmj.com/content/4/2/e100389