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新型环形纳米传感器阵列导管：实现膀胱癌原位化学成像检测

膀胱癌是全球第十大常见癌症，2020年新发病例约57.3万例，死亡病例约21.3万例。由于其高达50%以上的复发率以及需要频繁的膀胱镜监测，膀胱癌每位患者的终生治疗费用在所有癌症中居首位。目前，膀胱癌的金标准检测方法是膀胱镜检查，若发现可疑病变则需在手术室进行活检。基于尿液的检测方法虽然可利用尿液中的核基质蛋白22（NMP-22）、膀胱肿瘤抗原（BTA）等生物标志物，但面临着患者个体差异、尿液稀释和生物标志物降解等挑战。此外，蓝光膀胱镜、光声磁共振成像和正电子发射断层扫描计算机断层扫描等影像技术，在检测原位癌方面仍存在困难，因为其表面平坦且生物标志物丰度低，治疗后复发性癌症的检测同样面临类似问题。

麻省理工学院Michael S. Strano及其同事开发了一种环形纳米传感器阵列，将其接枝到标准医用导管上，实现了组织腔室或腔内空间的三维化学外排成像（图1A）。该平台将近红外荧光单壁碳纳米管集成到导管上，利用球透镜扫描光学器件进行化学信号映射。研究团队基于磷脂共聚物开发了选择性检测膀胱癌生物标志物NMP-22的纳米传感器（图1B）。结果显示，六种膀胱癌细胞系凋亡与健康成纤维细胞之间存在差异性的传感器响应。纳米传感器功能化的导管能够追踪吉西他滨刺激的细胞死亡，并在体外监测蛋白质外排。通过该平台，研究团队实现了入射化学通量的空间成像，可在复杂组织和器官中定位生物标志物来源，信号增强倍数达到提取生物流体采样的182倍。作为应用示例，该导管配备旋转球透镜，对猪膀胱进行化学成像，可在2厘米距离内检测生物标志物外排，展现了其作为床旁诊断工具的潜力。相关内容以“Chemical efflux imaging using an annular nanosensor array for in situ bladder cancer detection”发表在Nature Nanotechnology。

研究团队首先开发了用于检测膀胱癌生物标志物的合成共聚物。他们利用聚（异丁烯-alt-马来酸酐）与聚乙二醇和苄胺结合，形成独特的两亲性结构（图1A）。芳香环通过π-π堆叠作用作为单壁碳纳米管的锚定基团，而聚乙二醇链则为碳纳米管分散提供胶体稳定性，并在其末端含有识别位点用于分析物结合。通过将不同长度、电荷、疏水性和官能团的聚乙二醇结构分别偶联到聚合物骨架上，研究团队创建了一个合成共聚物文库，成功分散了单壁碳纳米管，得到15种具有近红外荧光光谱的独特纳米传感器阵列。

高通量筛选结果显示，DSPE₃纳米传感器在加入84 nM的NMP-22后表现出35.3%的荧光关闭响应，相较于其他尿液蛋白具有高特异性，且不同批次制备的传感器之间具有高重现性（图1B、1C）。该纳米传感器在20%人尿液中也表现出对NMP-22的荧光关闭响应。在0.04 nM至84 nM浓度范围内监测荧光信号，检测限达到34.04 nM（图1D、1E）。时间依赖性结果也证实了加入NMP-22后的荧光猝灭现象（图1F）。通过最大后验纳米粒子追踪分析和分子探针吸附研究，研究团队验证了这种荧光关闭响应是由于分子识别而非颗粒聚集所致。分子探针吸附研究定量了纳米粒子冠层内溶剂可及表面积的变化，证实了NMP-22吸附导致单壁碳纳米管暴露表面积减少（图1G、1H）。等温滴定量热法测得的结合亲和力为523±180 nM。该纳米传感器在25°C、37°C和4°C孵育后仍保持检测能力，荧光强度在3周内下降不到3%。

图1 | 膀胱癌生物标志物检测及结合表征。 a. 用于功能化纳米传感器以检测膀胱癌相关生物标志物的合成共聚物化学结构。纳米传感器通过基于PIMA的两亲性共聚物功能化，在链末端掺入基于PEG的多样化官能团用于分子识别。 b. 高通量筛选结果描述了在固定浓度20 μg/ml下，纳米传感器对膀胱癌生物标志物和其他蛋白的归一化响应。测试了15种由不同聚合物结构功能化的纳米传感器，证明DSPE₃纳米传感器选择性检测NMP-22。热图中的蓝色区域表示荧光开启响应，红色区域表示荧光关闭响应。 c. DSPE₃纳米传感器对NMP-22的高选择性，显示35.3%的荧光关闭响应。 d,e. NMP-22检测：荧光光谱（d）和归一化响应曲线（e）显示DSPE₃纳米传感器在NMP-22浓度增加时的荧光关闭响应。数据表示为均值±s.d.，n=3个独立纳米传感器样品。 f. DSPE₃纳米传感器在加入84 nM NMP-22后的时间依赖性响应。 g. 与NMP-22相互作用前后的MApNTA直方图，显示在与NMP-22相互作用后150–300 nm范围内颗粒数量有所增加。 h. 分子探针吸附研究确认了NMP-22吸附后溶剂可及表面积减少。在b、c、e和f中，实验独立重复三次，确认结果一致。

研究团队接着利用吉西他滨处理诱导细胞凋亡，验证了纳米传感器对凋亡细胞裂解物的响应（图2A）。吉西他滨通过膀胱灌注用于治疗膀胱癌。他们培养了六种不同膀胱癌细胞系和膀胱成纤维细胞作为阴性对照。结果显示，吉西他滨有效降低了膀胱癌细胞的活力：HT1197为17.8%，HT1367为6.6%，UM-UC-3为20.2%，HTB9为10.4%，HTB5为58.4%，HTB4为62.9%，而健康细胞保持了82.2%的高活力（图2B）。这种显著的凋亡差异导致癌细胞产生的裂解物量是健康细胞的三倍。荧光光谱显示，癌细胞裂解物引发荧光关闭响应，而健康细胞裂解物或未经吉西他滨处理的细胞裂解物引起的响应可忽略不计（图2C-2F）。NUMA siRNA敲低实验证实NMP-22对荧光猝灭有主要贡献，使用NUMA siRNA后纳米传感器响应从11.2%降至6.5%（图2G）。分子量分级实验确认大尺寸蛋白（>100 kDa）主要贡献了荧光关闭响应。蛋白质组学分析证实了NMP-22的存在，相对浓度为5.6 ng/ml。

图2 | 膀胱癌和健康细胞对吉西他滨的差异性响应。 a. 吉西他滨诱导细胞凋亡的示意图，释放可被DSPE₃纳米传感器检测的生物标志物。 b. 吉西他滨处理后膀胱细胞的细胞活力。膀胱成纤维细胞作为健康细胞对照。数据表示为均值±s.d.，n=3个独立样品。 c. 加入细胞裂解物后的荧光光谱。裂解物来自吉西他滨处理后的HTB9、HTB5、HTB4和UM-UC-3细胞以及健康成纤维细胞。 d-f. 对HTB9（d）、HTB5（e）和HTB4（f）细胞裂解物的时间依赖性纳米传感器响应。 g. siRNA实验确认NMP-22对荧光猝灭的贡献。NUMA siRNA(+)显示响应从11.2%降至6.5%。数据表示为均值±s.d.，n=3个独立纳米传感器样品。

为实现导管上的纳米传感器集成，研究团队利用多酚类物质的强涂层能力（图3A）。通过酚类网络，纳米传感器成功集成到医用导管的外表面，包括聚四氟乙烯1型、聚四氟乙烯2型、高密度聚乙烯和聚酰亚胺（图3B、3C）。经优化涂层条件后，高密度聚乙烯导管涂层产生了强烈且均匀的荧光信号。拉曼光谱在1580–1590 cm⁻¹处检测到G峰，证实了单壁碳纳米管纳米传感器接枝在导管表面，均匀涂层量为57.42±4.52 ng，涂层厚度约0.4 μm（图3D）。纳米传感器功能化导管对NMP-22和UM-UC-3细胞裂解物均表现出荧光关闭响应，而健康细胞裂解物引起的变化极小（图3E、3F）。导管对UM-UC-3细胞的归一化响应比健康成纤维细胞高出2.7倍。参考区域（纳米传感器用透明胶带密封）未显示荧光变化，表明测量过程中未发生光漂白或激光能量降低（图3G）。该涂层导管在不同pH值、流速和尿液条件下保持稳定信号，且在检测裂解物时荧光下降约20%，在灭菌过程中也表现出稳定的信号，对膀胱成纤维细胞显示出低毒性。

图3 | 使用纳米传感器功能化导管检测细胞裂解物。 a. 多酚类物质实现医用导管上纳米传感器涂层的示意图。DSPE₃纳米传感器接枝在经多酚类物质（即单宁酸）预处理的导管外表面。插入图显示固定在载玻片上的DSPE₃纳米传感器。下方的照片通过与5分硬币比较展示了医用导管的小尺寸。近红外图像显示优化涂层条件后导管上均匀的纳米传感器涂层。 b,c. 纳米传感器涂层导管的光学（b）和近红外（c）图像。虚线表示涂层区域，检查了四种医用导管类型，包括PTFE1、PTFE2、HDPE和聚酰亚胺。 d. 未处理、多酚涂层和纳米传感器涂层医用导管的拉曼光谱，确认了单壁碳纳米管的G峰。 e. 导管对NMP-22的时间依赖性响应。NMP-22导致导管荧光信号下降。 f. 导管对细胞裂解物的时间依赖性响应。UM-UC-3细胞的裂解物诱导荧光关闭响应，而健康细胞的裂解物表现出最小响应。在10分钟和20分钟两次加入PBS作为阴性对照。 g. 近红外图像显示导管与膀胱癌细胞裂解物相互作用时的荧光变化。f和g中使用的裂解物通过吉西他滨获得。g中白色虚线框表示防止裂解物与纳米传感器相互作用的参考区域。e-g中的测试使用HDPE导管。f中数据表示为均值±s.d.，n=3个独立导管样品。实验独立重复三次，确认一致结果。

研究团队进一步开发了球透镜光学装置来检测导管上涂覆的纳米传感器信号（图4A）。球透镜探针设计用于插入导管内部，外部涂有DSPE₃纳米传感器。探针使用561 nm激光激发纳米传感器，同时监测850 nm至1100 nm的光学信号。荧光信号随激光功率从1.0 mW增加到2.2 mW而增强，球透镜探针可监测0°至180°各角度的信号（图4B、4C）。使用选择性涂层导管，球透镜探针检测到的信号与近红外图像观察到的信号高度吻合（图4D）。研究团队利用该导管监测癌细胞分泌的蛋白质外排（图4E）。将UM-UC-3和健康成纤维细胞分别培养在圆柱形细胞培养管侧壁的底部区域。吉西他滨处理后，球透镜扫描了功能化导管10 mm的半圆柱区域，覆盖0°至200°的角度位置。结果显示，归一化荧光关闭响应起源于培养UM-UC-3细胞的底部区域，30分钟后响应增强并逐渐向上扩散，而健康成纤维细胞则表现出最小变化（图4F）。热图分析显示，UM-UC-3细胞培养区域的平均荧光关闭响应为25%，而健康细胞区域变化可忽略不计（图4G、4H）。

图4 | 癌细胞凋亡的三维化学外排成像。 a. 球透镜探针设计用于在561 nm激发传感器，同时读取光学信号（>850 nm）。照片显示插入导管的球透镜探针发出光。比例尺，5 mm。 b,c. 探针在平移（b）和旋转（c）方向上扫描接枝在导管上纳米传感器的荧光信号。在不同激光功率下测量不同平移阶段的纳米传感器信号。 d. 使用导管上选择性涂层的纳米传感器确认球透镜探针性能。对棕色区域应用掩蔽方法，在蓝色区域进行选择性纳米传感器涂层。球透镜测量的光学信号与近红外图像中的信号相匹配。 e. 用于生物标志物外排映射的圆柱形体外模型示意图。纳米传感器功能化导管与球透镜监测红色标记区域培养的UM-UC-3和健康细胞分泌的蛋白质外排。 f. 三维化学成像显示UM-UC-3细胞的归一化荧光关闭响应，而健康细胞显示最小响应。 g,h. 热图显示健康（g）和癌（h）细胞扫描导管区域的归一化纳米传感器响应。热图中每个像素对应导管区域10°×1 mm内的纳米传感器响应。

在空间成像能力验证中，UM-UC-3和健康成纤维细胞被选择性培养在4孔细胞培养腔室载玻片中，UM-UC-3细胞分别位于底部、中部和顶部位置，其余区域培养健康成纤维细胞（图5A）。吉西他滨预处理后，导管与细胞培养载玻片对接，在与UM-UC-3细胞区域对应的位置观察到荧光关闭响应，而健康区域响应极小（图5B）。检测范围测试表明，距离为1 cm时导管平均荧光关闭响应为18%，2 cm时为10%，4 cm时仅为2%，确认检测范围可达2 cm（图5C-5E）。与稀释10倍的生物标志物溶液相比，1 cm实验的平均导管响应高出182倍，表明在源附近进行分析物检测可显著增强探针性能。模拟肿瘤尺寸测试中，UM-UC-3细胞培养在4 mm²、16 mm²和64 mm²的特定区域（图5F），导管对这三种尺寸的平均荧光关闭响应分别为6%、11%和15%，而64 mm²健康细胞对照实验显示仅5%的微小响应，证实导管可检测小至16 mm²模拟肿瘤的生物标志物外排（图5G、5H）。

图5 | 化学成像导管的性能。 a. 空间测试体外装置示意图。UM-UC-3和健康细胞分别在指定的红色和绿色区域培养。 b. 导管对培养在底部、中部和顶部位置的膀胱癌细胞的归一化响应。在UM-UC-3细胞培养区域观察到荧光关闭响应。热图显示扫描导管区域的归一化纳米传感器响应，确认了生物标志物外排的空间成像。 c. 检测范围测试示意图，检查导管与分析物源之间不同距离下的导管响应。 d,e. 热图（d）和平均导管响应（e）显示随着与源距离增加导管响应下降。10倍稀释样品的响应大幅减弱。模拟肿瘤指UM-UC-3细胞培养区域。 f. 对不同大小模拟肿瘤的响应测试。UM-UC-3细胞培养在4 mm²、16 mm²和64 mm²的区域。光学图像显示低倍（左）和高倍（右）放大下在特定区域生长的细胞。比例尺，25 μm和5 μm。 g,h. 热图（g）和平均导管响应（h）显示导管检测16 mm²（P=0.006）和64 mm²（P=0.001）大小UM-UC-3细胞培养物蛋白质外排的能力。**P<0.01，双尾Student t检验。数据表示为均值±s.d.，n=3个独立导管区域。实验独立重复三次，确认一致结果。

为展示转化应用潜力，研究团队构建了一个可移动仪器，支持基于导管的化学成像（图6A）。该机械装置结合了旋转和平移平台，实现对球透镜定位的三维控制，支持15 cm平移运动和360°角扫描，可进入猪膀胱深部组织区域（图6B）。功能化导管在猪膀胱中检测NMP-22，表现出20%的荧光关闭响应，具有高重现性（图6C）。当在导管1 cm范围内不同平移位置注射裂解物（20 μg）时（图6D），10分钟后在生物标志物释放区域观察到局部最大荧光关闭响应为18–23%，而阴性对照无响应（图6E）。在猪尿道中也确认了15–18%的局部最大荧光关闭响应（图6F、6G）。该化学成像导管在合成尿液条件下可检测2 cm范围内释放的生物标志物外排，而在4 cm处响应极小。在不同体积（70 mL、200 mL和400 mL）的猪膀胱中，导管响应分别为16.8%、15.8%和14.2%。裂解物浓度从0 μg至37.5 μg的剂量反应校准曲线确认检测限为17.6 μg。此外，涂有(GT)₁₅纳米传感器的导管（广泛用于选择性检测H₂O₂）对H₂O₂释放表现出14%的荧光关闭响应，证实该平台可通过替换导管上涂覆的纳米传感器来检测不同分析物的多功能性。

图6 | 猪膀胱和尿道的三维化学成像。 a. 用于猪膀胱筛查的化学成像装置俯视照片。该装置包括机械平台（1）、APD检测器（2）和双通道光纤（3）。 b. 使用化学成像导管在不同位置进行猪膀胱映射的照片。球透镜插入膀胱，绿光表示球透镜发出的光。 c. 导管与猪膀胱中NMP-22相互作用后的平均响应（P=0.0004）。***P<0.001，双尾Student t检验。数据表示为均值±s.d.，n=3个独立导管区域。 d. 使用注射器局部释放NMP-22（84 nM）。d中箭头表示注射NMP-22（ii）或裂解物（i-iii）的区域。 e. 化学成像导管的空间响应。在裂解物注射位点（i-iii）观察到明显的荧光关闭响应。 f. 化学成像导管在猪尿道中筛查的照片。 g. 三维化学成像显示在腔内空间绘制传感器响应的能力。条形图显示导管在平移和旋转方向局部最大值的响应。比例尺，6 cm（b）和2 cm（f）。c、e和g中的实验独立进行三次，确认补充图中显示的一致结果。扩展数据图3–7展示了各种条件下的综合三维化学成像数据。

总结与展望

本研究开发的基于纳米传感器功能化导管与旋转球透镜集成的原位诊断平台，有效克服了生物体液中生物标志物检测因显著稀释和降解而受限的问题。工程化的DSPE₃纳米传感器通过掺入磷脂结构的合成聚合物实现了对NMP-22的选择性检测。研究团队建立了吉西他滨诱导癌细胞凋亡的体外模型，并通过siRNA实验证实NMP-22对观测信号的主要贡献。利用多酚类物质将纳米传感器接枝到医用导管上，球透镜光学系统实现了纳米传感器响应的直接读出和三维化学信号映射。该平台在猪膀胱模型中展示了空间成像能力，以及在生理条件下的高稳定性、安全性和重现性。未来工作将聚焦于传感器开发、分析物研究和先进光学工程。鉴于膀胱癌分泌的分析物多样性，整合多个识别元件的多路复用传感器阵列可大幅提高诊断精度，这需要探索具有多种结合位点的全新分子结构。此外，蛋白质组学等组学研究可验证临床样本中的生物标志物并指导合理的纳米传感器设计。最后，通过运动学耦合、比率测量和光纤对准可进一步优化设备性能，提高信号精度、降低噪声并增强稳定性。总之，这一旨在检测局部生物标志物的化学成像平台，通过最大限度减少稀释和降解效应，有望克服传统筛查分析的性能局限。