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背景介绍

口腔黏膜感染是一种常见的口腔软组织疾病，由微生物感染或非感染性因素诱发，临床表现多样、发病机制复杂。目前临床治疗主要依赖抗感染药物、免疫疗法及物理治疗，但抗生素和免疫抑制剂的滥用已成为公共卫生问题，导致更多医疗挑战。与无菌伤口不同，口腔感染伤口中病原体及其代谢产物的持续刺激可能引发严重的炎症风暴，使伤口愈合更加困难。活性氧（ROS）在伤口愈合的不同阶段具有双重作用：早期需要产生ROS杀灭病原体，后期则需要降低ROS水平以促进组织修复。然而，同时实现这两个目标似乎不可能。此外，重塑免疫微环境对于口腔伤口愈合也至关重要。因此，开发一种能够根据感染伤口微环境动态变化自适应调控ROS产生与清除的智能系统，具有重要的临床意义。

研究思路

针对上述挑战，吉林大学口腔医院刘震教授、胡敏教授及包幸福教授团队提出了一种基于牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）来源的免疫纳米酶（P-dots），作为智能微环境自适应调控器，用于口腔黏膜感染的程序化级联治疗。研究团队通过简单的一步水热法，以富含铁卟啉的P. gingivalis为前驱体制备了P-dots。得益于保留了血红素的活性Fe-N₄中心及与P. gingivalis相似的分子模式，P-dots展现出优异的多酶催化活性（过氧化物酶样、过氧化氢酶样和超氧化物歧化酶样）和理想的免疫调节功能。更为重要的是，P-dots能够根据口腔感染伤口微环境的变化动态调控ROS的产生与清除：在感染早期酸性微环境中，P-dots发挥POD样活性产生ROS杀灭细菌；消毒后，随着伤口微环境恢复中性，P-dots切换为CAT/SOD样活性清除多余的ROS。同时，P-dots通过逆转巨噬细胞极化（抑制M1、促进M2）实现免疫调节，促进口腔黏膜修复。转录组测序进一步揭示P-dots参与的治疗能够下调NF-κB信号通路相关基因，上调胶原再生、血管生成和免疫调节相关基因。相关内容以“Porphyromonas gingivalis-Derived Immunologic Nanozymes as Smart Microenvironment-Adaptive Regulators for Programmed Cascade Treatment of Oral Mucosal Infection”为题，发表在ACS Nano。

图片解析

图1. P-dots的理性设计及用于口腔黏膜感染程序化治疗的示意图： (A) P-dots的合成与结构：以牙龈卟啉单胞菌为前体，通过水热法制备具有多酶催化活性的P-dots，保留血红素结构。(B) P-dots用于口腔黏膜感染程序化治疗：包括抗菌、抗炎和原位免疫调节三个主要环节。

图2. P-dots的合成与理化表征： (a) TEM图像显示P-dots呈点状形貌，平均直径4.75 nm。(b) 广角XRD图谱显示21.3°处宽衍射峰，表明无定形碳组分。(c) Raman光谱显示D峰与G峰强度比为1.04。(d) XPS全谱及高分辨Fe 2p和N 1s谱，证实Fe-N键的存在。(e) FT-IR光谱显示P-dots保留了P. gingivalis和血红素的主要官能团。(f) P-dots在不同生理溶液中的分散性良好。(g) Fe K-edge XANES光谱显示P-dots中Fe的价态位于Fe₂O₃和Fe箔之间。(h) Fe K-edge EXAFS傅里叶变换分析显示1.6 Å处主峰归属于Fe-N散射路径。(i) 小波变换分析证实P-dots中Fe-N键为主。(j,k) R空间和k空间EXAFS拟合，Fe-N配位数约为4.1，键长1.99 Å。

图3. P-dots的微环境自适应多酶活性及DFT计算： (a) 示意图。(b-c) 不同条件下oxTMB在652 nm处吸光度，证明P-dots具有POD样活性。(d) ESR谱证实·OH的生成。(e) DFT计算POD样催化反应路径及自由能变化，决速步为H₂O脱附。(f-g) MB降解实验及H₂O₂清除率，证明CAT样活性。(h) ESR谱证实H₂O₂清除能力。(i) DFT计算CAT样催化路径，决速步为O₂脱附。(j-k) NBT还原实验及O₂⁻清除率，证明SOD样活性。(l) ESR谱证实O₂⁻清除能力。(m) DFT计算SOD样催化路径，决速步为吸附H₂O₂的形成。

图4. P-dots的生物安全性评价： (a) 安全性评价示意图。(b-c) L929细胞和rBMSCs与不同浓度P-dots共培养后的活/死染色图像，无明显细胞毒性。(d) 溶血率均低于1%。(e) 凝血酶原时间和凝血酶时间均在正常范围内。(f) 小鼠局部给药后体重变化无显著差异。(g-h) 血液学指标和血生化指标均正常。(i) 主要组织（心、肝、脾、肺、肾、口腔黏膜、胃、小肠、结肠）的H&E染色未见病理变化。

图5. P-dots参与的体外抗菌性能及抗菌机制： (a) 不同处理后金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的浓度依赖性细菌存活率。(b-c) 菌落平板照片及计数显示P-dots+H₂O₂组抗菌效果最佳。(d) SEM图像显示P-dots+H₂O₂组细菌皱缩甚至完全裂解。(e) SDS-PAGE显示P-dots+H₂O₂组细菌胞内蛋白泄漏最严重。(f) 细菌内ROS成像显示P-dots+H₂O₂组荧光最强。(g) PCoA分析显示对照组与P-dots+H₂O₂组之间菌群差异。(h) 差异表达基因火山图。(i) GO富集分析。(j) KEGG通路富集分析。(k) 与柠檬酸循环、DNA修复等相关的DEGs热图。(l) fH、ftsY等基因表达水平变化。

图6. P-dots体外诱导巨噬细胞极化和炎症/ROS调控： (a) 实验设计示意图。(b) RAW264.7细胞在不同浓度LPS、P-dots或P. gingivalis裂解液中的活力。(c) 不同处理后RAW264.7细胞形态变化。(d-e) 免疫荧光显示P-dots降低CD86（M1标志）表达、升高CD206（M2标志）表达。(f-g) 流式细胞术定量证实P-dots促进M2极化。(h) ROS调控实验设计。(i-j) L929和RAW264.7细胞中ROS荧光成像及相对荧光强度显示P-dots有效清除细胞内ROS。

图7. P-dots参与系统对金黄色葡萄球菌辅助口腔黏膜感染的体内治疗效果： (a) 实验设计及检测。(b) 不同治疗后7天内伤口照片及伤口闭合轨迹。(c) 伤口愈合率定量：P-dots+H₂O₂组达88.6%。(d) 伤口细菌菌落照片及计数显示P-dots+H₂O₂组细菌数最低。(e) H&E和Masson染色显示P-dots+H₂O₂组组织完整、胶原沉积增加。(f) 免疫荧光和DHE染色显示P-dots+H₂O₂组炎症因子降低、ROS水平降低、VEGF升高。(g) 黏膜损伤评分雷达图显示P-dots+H₂O₂组面积最小。(h) C反应蛋白含量在P-dots+H₂O₂组降至正常水平。(i) PCoA和NMDS分析显示P-dots+H₂O₂组对口腔微生物群无显著扰动。

图8. P-dots参与程序化治疗的转录组学分析： (a) PCoA显示不同组样本聚类。(b) DEGs维恩图。(c) 差异表达基因火山图。(d) GO富集分析显示P-dots+H₂O₂组富集于细胞因子产生、白细胞趋化、胶原原纤维组织、血管生成等。(e) KEGG通路富集分析显示P-dots+H₂O₂组下调IL-17、TNF、NF-κB、NOD样受体信号通路，上调ECM-受体相互作用、细胞黏附分子、TGF-β信号通路。(f) 与NF-κB通路、炎症反应、过氧化物酶体、胶原原纤维组织、血管生成、免疫反应相关的DEGs热图。

图9. P-dots参与系统对大肠杆菌辅助口腔黏膜感染的体内治疗效果： (a) 实验设计。(b) 7天内伤口照片及伤口闭合轨迹。(c) 伤口愈合率定量。(d) 伤口细菌菌落照片及计数显示P-dots+H₂O₂组抗菌效果最佳。(e) H&E和Masson染色显示P-dots+H₂O₂组炎症细胞减少、胶原纤维增加。

结论

本研究成功开发了来源于牙龈卟啉单胞菌的免疫纳米酶（P-dots），并将其作为智能微环境自适应调控器用于口腔黏膜感染的程序化级联治疗。P-dots通过保留血红素的Fe-N₄活性中心，展现出过氧化物酶样、过氧化氢酶样和超氧化物歧化酶样三重酶活性，能够根据伤口微环境的pH变化动态调控ROS的产生与清除——酸性条件下杀菌、中性条件下清除多余ROS。同时，P-dots保留了P. gingivalis的表面分子模式，能够有效逆转巨噬细胞极化（抑制M1、促进M2），实现免疫调节。体内动物实验（金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染模型）证实，P-dots+H₂O₂系统具有最佳伤口愈合率（88.6%）、最强抗菌效果、最完整的组织结构和最丰富的胶原沉积。转录组学分析进一步揭示了P-dots参与的治疗下调NF-κB等炎症信号通路，上调胶原再生、血管生成和免疫调节相关基因。该智能纳米系统不仅为口腔黏膜感染的动态全阶段治疗提供了理想策略，也为基于工程化细菌构建新型生物材料开辟了新途径。

原文链接：

https://doi.org/10.1021/acsnano.6c03962