光动力疗法（PDT）是一种无创肿瘤治疗策略，通过采用光敏剂结合光源进行肿瘤治疗的新兴技术。然而，常规PDT中光敏剂面临光毒性强和靶向性不足等问题限制了其在临床中的进一步应用。结合肿瘤微环境（TME）有利于克服PDT靶向性不足以提高治疗效果，目前，基于TME的治疗策略主要集中在响应性药物递送系统的开发，以达到靶向治疗效果，而利用TME启动PDT不仅能提高治疗的靶向性还能有效降低光毒性。鉴于光动力疗法的局限性，迫切需要开发具有低光毒性和优异靶向性的光敏剂来提高光动力疗法的治疗效果。

针对上述挑战，南华大学胡蓉教授和袁熠教授联合张晓东教授研发了一种一氧化氮（NO）可激活的光敏剂，该光敏剂具有内质网（ER）靶向性及NO响应性，可用于开发精确治疗肿瘤策略。通过特异性激活和内质网靶向提供双重选择性，在体外和体内均显示出对肿瘤细胞的良好抑制作用，获得了理想的肿瘤治疗效果。这项工作为构建智能PDT治疗策略提供了新的研究思路。

这项工作中报道了一种NO响应型的“turn-on”光动力治疗策略，用于肿瘤高效抑制。

设计并制备了几种邻噻吩二胺衍生物，基于其与NO反应生成三氮唑衍生物从而增强分子内电荷转移（ICT），实现光敏性能的智能调控。通过对制备的邻噻吩二胺衍生物进行构效关系研究发现：1）具有较高电子密度的邻噻吩二胺衍生物显示出更强的NO响应性。2）所制备的邻噻吩二胺衍生物均能通过增强D-A相互作用开启其光敏性能。3）所有衍生物中仅具有内质网靶向的TA-DTO展良好的PDT效果，有望成为具有高安全性、强靶向性的抗肿瘤新策略。

图1 邻噻吩二胺衍生物结构式及光物理性能。A）化学结构。B）光物理特性。C）优化的分子几何结构。

光物理性能研究显示，所制备的邻噻吩二胺衍生物主要吸收带位于 350–420 nm 区域，发射峰值范围为 451 至 474 nm。Log P值表明，与TA-DPA、TA-TPA和TA-TPAMO相比，TA-DTO呈现出一定的亲水性。密度泛函理论（DFT）计算结果显示：TA-DPA、TA-TPA 和 TA-TPAMO 有用相似的分子构象，其苯环取代的噻吩结构趋近于平面而外周芳香胺结构则更扭曲；TA-DTO 拥有更平面的构象，其分子结构中噻吩核和相邻 EDOT 基团之间的二面角仅为5.8°。

图2 TA-DTO对NO的响应性。A）TA-DTO 对 NO 形成 TT-DTO 的示意图。B）TA-DTO 对不同浓度 BNN6 的反应（n = 3）。C）TA-DTO 对不同浓度 H₂O₂ 的反应（n = 4）。D） TA-DTO在光照（白光：35 mW/cm²）下的反应（n = 3）。E）TA-DTO和TT-DTO在光照（白光：25 mW/cm²）下产生的ROS（n = 3）。

接下来系统地研究了分子对 NO 的响应性，以TA-DTO为例，在NO存在的情况下TA-DTO发生单电子转移氧化生成三唑衍生物TT-DTO（图2A）。循环伏安法研究证明TA-DTO具有更高的HOMO能级，表明其越容易被NO氧化生成TT-DTO。研究证明，随着NO供体BNN6的加入， TA-DTO吸收光谱发生显着红移，并且随着作用时间延长，长波长处新吸收峰进一步提高，证明其与NO发生反应生成了更强D-A相互作用的TT-DTO（图2B）。与此同时，相同条件下TA-DPA、TA-TPA 和 TA-TPAMO 也有类似的现象发生，但反应活性不及TA-DTO。进一步研究显示，其他氧化性物质比如双氧水并不能诱导发生该类氧化成环反应的发生（图2C）。值得注意的是，TA-DTO在没有BNN6存在的情况，仅光照也能观测到吸收光谱红移（图2D），这可能与大气中有微量活性氮物种存在的原因。鉴于氧化后的三氮唑衍生物具有更强的D-A相互作用，作者推测其光敏产生ROS会存在较大差异，因此对氧化前后的分子光敏化行为进行了对照研究，结果证明TA-DTO光照条件下几乎不能产生ROS，但是氧化成环后的TT-DTO则展现出优异的光敏化能力（图2E），证明该类分子具有NO响应启动PDT潜力。

图3 体外肿瘤抑制表征。A）4T1 细胞经TA-DPA/TPA-TPA和溶酶体探针、TA-TPAMO和脂滴探针、TA-DTO和内质网探针共同染色，以及经 TN-DTO 处理后的 共聚焦成像。标尺: 20 μm。不同浓度的 TA-DPA、TA-TPA、TA-TPAMO、TA-DTO 在无B） 白光和有C） 白光照射（18 mW/cm²，15 分钟）培养 24 小时后的细胞存活率（n = 6）。D）使用 DCFH（10 μM，30 分钟）和 DAF-FM（5 μM，30 分钟）检测进行不同处理时细胞内 ROS 和 NO 的生成情况。E）4T1 细胞在不同处理下产生的细胞内氧化应激情况。“L”代表白光，标尺: 50 μm。数据以均数 ± SD（标准差）表示，*p ≤ 0.05；**p ≤ 0.01；***p ≤ 0.001。

在验证这些光敏剂在响应型 PDT 应用中的潜力后，作者进一步评估了其生物成像及PDT行为。如图3A所示，结果表明这些分子均可以高效穿过细胞膜，进一步共定位研究表明，随着分子亲水性不断增加，分子依次表现出溶酶体、脂滴及内质网靶向性。细胞毒性结果显示，邻噻吩二胺衍生物在暗条件下没有明显毒性（图3B）。但随着光照激发，仅仅TA-DTO展现出对4T1细胞有明显杀伤效果（图 3C），证明了其在细胞层面有优异的PDT效果，这主要与其内质网靶向能力有关。结合胞内活性氧探针及NO探针表征显示，TA-DTO会诱导细胞内ROS和NO水平明显增强（图3D），并进一步诱导肿瘤细胞氧化应激（图3E），从而诱导细胞死亡。作者还结合了RNA-seq研究发现，TA-DTO主要通过上调氧化相关信号通路、下调细胞代谢信号通路实现了对肿瘤细胞的抑制。

图4 体内肿瘤抑制表征。A）体内抗肿瘤流程图。B）不同治疗方案下 4T1 肿瘤小鼠的体重（n = 4）。C）不同治疗方案下 4T1 荷瘤小鼠肿瘤体积的相对变化（n = 4）。D）不同治疗结束时 4T1 荷瘤小鼠切除肿瘤的照片（n = 5）。I）PBS；II）PBS + 光；III）TA-DTO NPs；IV）TA-DTO NPs + 光。白光：200 mW/cm²，20 分钟。E）不同处理第 15 天后肿瘤组织的 H&E 和 TUNEL 染色图像。I）PBS，II）PBS + 光，III）TA-DTO NPs，IV）TA-DTO NPs + 光。标尺: 100 μm（H&E）和 20 μm（TUNEL）。F）TA-DTO 的溶血试验（n = 3）。不同治疗结束时 4T1 荷瘤小鼠血液生化指标肝功能指标（G-I）和肾功能指标（G）（n = 3）。数据以均数 ± SD 表示，*p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01; ***p ≤ 0.001。

在细胞层面证明了TA-DTO优异的NO响应PDT潜力后，作者进一步探索了其活体肿瘤抑制效果。如图4A所示，作者通过构建皮下肿瘤模型，静脉注射TA-DTO纳米颗粒24小时后进行光照射，记录并监测不同处理下的体重和肿瘤生长情况，持续15天。如图4B所示，与对照组相比，不同处理组小鼠的体重没有明显变化，证明纳米粒子没有明显毒性。通过监测肿瘤体积及生长情况评估治疗效果发现，仅TA-DTO纳米粒子处理小鼠组光照条件下肿瘤生长被显着抑制，证明了其理想的PDT效果（图4C和4D）。为了进一步研究其抑制机理，TUNEL染色显示光照TA-DTO处理小鼠组通过诱导实体瘤细胞凋亡从而达到抑制肿瘤生长的效果（图 4E）。生物安全实验研究显示在不同浓度的 TA-DTO 下均未检测到溶血现象，且通过对肝脏中的功能性生物标志物白蛋白和碱性磷酸酶（ALB、ALP）以及肾脏中的功能性代谢终产物血尿素氮（BUN）水平进行血生化评估均在正常范围内，表明TA-DTO不会对小鼠产生明显损害（图 4G-I）。综合结果表明，该PDT策略具有良好的肿瘤抑制功效和优异的生物安全性。

【结论与展望】

综上所述，作者开发了一种光照促进的NO响应型光敏剂用于降低光毒性实现肿瘤精准治疗。该工作中，作者通过与NO反应调节分子内ICT过程，构建了四种具有反应可调D/A推拉电子效应的邻噻吩二胺衍生物光敏剂，其中具有高电子密度的TA-DTO光敏剂对NO表现出高灵敏度，且所生成的三氮唑衍生物具有增强的D-A相互作用并展现出“turn-on”型光敏行为。TA-DTO良好的亲水性和二胺基团赋予其ER靶向能力。最终，由于TA-DTO优异的NO响应性和ER靶向性，在细胞及活体层面均展现出对肿瘤细胞良好抑制作用。这项工作将吸引更多的见解，为构建可调控的PDT治疗应用策略提供新思路。

原文链接：

https://doi.org/10.1002/adhm.202404265

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