肝肠循环是一种重要的生物过程

肝肠循环（Enterohepatic Circulation, EHC）是正常调节许多内源性生物分子代谢和各种外源性物质滞留的重要生物行为，对维持生命体稳态起到重要作用。参与EHC的分子最初在肝脏中产生或积累，然后转移到胆囊，随后通过胆汁分泌物运输到小肠。部分分子在回肠中发生重吸收，通过门静脉转移回肝脏，而其余部分通过粪便清除。各种内源性的脂溶性信使生物分子，如胆汁酸和胆红素，依赖于EHC过程来发挥其部分甚至大部分的生理功能，这种循环也促进了维生素、叶酸特别是临床药物等一系列外源性物质的重吸收，有利于延长它们的作用时间，提高其生物利用度。因此，EHC是药代动力学和毒理学研究中经常考虑的关键过程。EHC的功能不仅受到胆汁分泌障碍的影响，如异常胆汁代谢和胆管堵塞，还受到许多消化系统甚至循环系统疾病的影响，包括炎症性肠病（inflammatory bowel diseases, IBD）、药物性肝损伤（drug-induced liver injury, DILI）和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）。然而，实现这一过程的体内实时可视化仍然是一个挑战。

磁共振成像可以进行活体深层组织的实时监测

磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging, MRI）是一种强大的生物医学成像技术，具有无电离辐射、理想的组织穿透能力、多参数多剖面成像等优点。其中，¹H MRI已经成为临床上使用最为广泛的诊断技术之一，可提供良好的解剖结构信息。与此同时，¹⁹F MRI技术可以实现无生物背景的活体成像，与¹H MRI优势互补，提供分子水平的关键信息。为了实现短时¹⁹F MRI，获得高时空分辨率的信息，可以通过在探针结构中引入顺磁性金属离子，利用其顺磁弛豫增强效应，（Paramagnetic Relaxation Enhancement, PRE），合理地调控探针内¹⁹F原子的弛豫时间，以缩短成像时间，进而提高信噪比。更重要的是，氟化探针中顺磁性金属离子的存在可以显著增加其水溶性，而螯合物所具有的正电荷或负电荷有助于它们在有机阳离子转运体（organic cation transporters, OCTs）和有机阴离子转运多肽（organic anion transporting polypeptides, OATPs）的介导下进行摄取，为实现多种生物过程的监测奠定了基础。

灵敏型¹⁹F MRI对肝肠循环可视化

近日，厦门大学化学化工学院高锦豪/林泓域教授团队在肝肠循环示踪成像的研究中取得重要进展，相关结果以“Visualizing Enterohepatic Circulation In Vivo by Sensitive ¹⁹F MRI with a Fluorinated Ferrous Chelate-Based Small Molecule Probe”为题在线发表于Biomaterials（DOI：10.1016/j.biomaterials.2024.123073）。本研究开发了一系列基于氟化DO3A衍生物的金属螯合物型水溶性¹⁹F MRI小分子探针，其中Fe(II)的螯合物DO3A-Fe(II)-9F显示出最佳的成像性能，合适的PRE强度使其信噪比相较于单独的配体增加了18倍，为实现更高时空分辨率的灵敏型¹⁹F MRI提供了可能性。DO3A-Fe(II)-9F的负电荷、高氟含量（>20% wt）和优异的水溶性促进了其参与OATPs介导的EHC，使其可以通过短时¹⁹F MRI对静脉注射或口服该探针的健康小鼠体内这一关键过程进行无生物背景信号的实时监测（图1）。

图1. 灵敏型¹⁹F MRI小分子探针DO3A-Fe(II)-9F的设计思路、参与肠肝循环生物行为并进行实时监测的示意图。

具体来说，尾静脉注射DO3A-Fe(II)-9F的小鼠，在¹⁹F MRI冠状面图像中的胆囊区域可见强烈的¹⁹F信号，在给药后40分钟达到峰值，表明DO3A-Fe(II)-9F在肝脏中积聚并通过胆汁分泌排泄。小肠区域的¹⁹F信号也保持在相对较高的水平，表明DO3A-Fe(II)-9F进入小肠。由于大肠区域仅显示微弱的¹⁹F信号，说明DO3A-Fe(II)-9F在小肠区域发生了显著的再吸收，标志着其参与了EHC。同时，在膀胱区域也观察到强烈的¹⁹F信号，说明DO3A-Fe(II)-9F的小尺寸和高水溶性促进了其被肾脏清除。同时，作者在给药后的指定时间点处死用DO3A-Fe(II)-9F处理的正常小鼠，并收集其主要器官和排泄物，通过¹⁹F NMR进行生物分布分析。定量生物分布分析的结果与¹⁹F MRI结果的趋势一致。因此，DO3A-Fe(II)-9F通过静脉注射进入循环系统后，其中一部分会进行肾脏清除，而其余大部分会积聚在肝脏中，并通过胆汁分泌进入小肠。随后，探针的大部分会被小肠重新吸收，留下一小部分通过粪便清除。这些结果均展现了DO3A-Fe(II)-9F在体内可视化EHC的可行性（图2）。此外，作者还通过口服等多种方式观察了探针DO3A-Fe(II)-9F的肝肠循环过程，并借助OATPs阻断实验进一步验证了DO3A-Fe(II)-9F的代谢循环机制。

图2. （a）探针DO3A-Fe(II)-9F的活体实验流程图；（b）尾静脉注射探针后活体健康小鼠的¹H/¹⁹F磁共振成像；（c）SNR分析；（d）¹⁹F NMR生物分布定量分析实验流程图；（e）生物分布定量分析结果图；（f）探针DO3A-Fe(II)-9F在健康小鼠中的代谢循环机制图。

探针DO3A-Fe(II)-9F对监测肝肠系统相关疾病

利用探针DO3A-Fe(II)-9F可参与肝肠循环这一重要特点，作者进一步在肝肠相关的疾病模型上利用探针进行了快速¹⁹F MRI。作者分别构造了炎症性肠病（IBD）、药物性肝损伤（DILI）及其恢复和原位肝细胞癌（HCC）等动物模型，评估了DO3A-Fe(II)-9F监测受损EHC的能力。基于所获得的不同图样的¹⁹F MRI图样，作者分别在IBD、DILI等模型中观察到了小肠重吸收、肝脏富集能力的下降或阻断。例如，患有IBD的小鼠，可在大肠区域（主要是结肠）观察到强烈的¹⁹F信号，证明小肠的重吸收过程受到了严重影响，使得探针继续下行至结肠区域（图3）。

图3. （a）IBD模型的构建及探针DO3A-Fe(II)-9F的活体实验流程图；（b）尾静脉注射探针后活体IBD小鼠的¹H/¹⁹F磁共振成像；（c）90分钟的¹⁹F MRI放大图；（d）SNR分析；（e）探针DO3A-Fe(II)-9F在IBD小鼠中的代谢循环机制图。

而DILI模型下的小鼠，在肝脏和小肠区域仅观察到微弱的¹⁹F信号，相较于正常组显著降低，表明DO3A-Fe(II)-9F在肝脏中积累且随后的分泌能力明显受损。相比之下，经GSH处理的小鼠的胆囊和小肠区域可以看到逐渐增强的显著¹⁹F信号，表明GSH处理后肝功能的恢复（图4）。对于原位肝癌小鼠，也获得了两种不同时期病程下的初步结果。以上结果均加深了探针DO3A-Fe(II)-9F在病理条件下的代谢过程的理解，也丰富了对EHC的实时监测方法，并对肝肠相关的各种疾病的研究、诊断甚至分类提供了全新的思路和策略。

图4. （a）DILI及其恢复模型的构建及探针DO3A-Fe(II)-9F的活体实验流程图；（b、c）尾静脉注射探针后活体DILI及DILI恢复的小鼠的¹H/¹⁹F磁共振成像；（d、e）SNR分析；（f）探针DO3A-Fe(II)-9F在DILI小鼠中的代谢循环机制图。

【总结与展望】

总的来说，作者通过小分子探针DO3A-Fe(II)-9F实现了对肝肠循环的活体示踪成像，并对肝肠系统相关疾病进行了监测。作者指出，设计这类探针需要精确控制氟含量，以保持成像性能和水溶度之间的微妙平衡。此外，许多具有不同化学位移的含氟砌块可以很容易地集成到探针中，用于同时跟踪多个生物过程。本工作所体现的¹⁹F MRI探针设计策略，即利用金属离子赋予有利的物理化学和成像特性在氟化小分子，激励了进一步发展更多的高性能¹⁹F MRI探针以可视化不同的体内生物过程，有助于克服¹⁹F MRI探针向临床转化过程中的各种障碍。

该工作在厦门大学化学化工学院高锦豪教授和林泓域副教授的指导下完成。博士研究生李凌轩为论文的第一作者，厦门大学生命科学学院李奥博士为共同第一作者。本研究得到了国家自然科学基金（22125702、22077107、22477104和82402239）和福建省自然科学基金（2023J06002）等资助。

原文链接：

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Tags： 厦门大学高锦豪/林泓域教授团队《Biomaterials》：监测活体内肝肠循环过程的灵敏型¹⁹F磁共振成像