小细胞肺癌（SCLC）是一种侵袭性神经内分泌肿瘤，其组织样本通常不足以进行详细的免疫表型分析和深度基因组分析，人们难以将SCLC的生物学特征与临床试验中的治疗反应联系起来。液体活检可以减少或避免组织活检，改善SCLC患者的护理。一些开创性的最新研究分析了cfDNA片段化模式以推断核小体在来源细胞中的定位。因为核小体定位受到TF和其他基因表达调控蛋白质的强烈影响，所以TF活性和基因表达可以直接从cfDNA覆盖模式中推断出来。这种策略被称为cfDNA核小体分析，已被用于包括癌症检测在内的多种重要应用。

美国华盛顿州弗雷德·哈钦森癌症中心的Gavin HA和David Macpherson研究团队在Science Advances发表了题为“Molecular phenotyping of small cell lung cancer using targeted cfDNA profiling of transcriptional regulatory regions”的文章，报告了报一种基于SCLC cfDNA靶向测序的癌症表型方法。研究团队基于新的靶向捕获panel开发了一种新的cfDNA核小体分析方法，称为SCLCpheno-seq，该方法通过对数千个转录起始位点（TSS）和TF结合位点（TFBS）周围的cfDNA进行靶向测序，能够实现SCLC和NSCLC的组织学区分，并通过推断TF活性无创地预测SCLC亚型。总的来说，靶向cfDNA核小体分析是一种实用而准确的方法，可用于无创预测癌症患者的关键肿瘤特征，有可能大大加快患者护理的改善。

文章发表于Science Advances

01 cfDNA测序用于肿瘤TF活性和基因表达的综合突变检测和推断

研究团队设计了一种定制的靶向测序panel，用120-bp探针靶向13.7 Mb，同时鉴定体细胞突变，并从血浆cfDNA中推断TF活性和基因表达（图1A）。该靶向测序panel可以识别1535个TF结合位点和13240个基因TSS的染色质组织特征，并检测842个基因的外显子突变。

将靶向测序panel应用于携带SCLC或NSCLC PDX模型的小鼠血浆样本以及SCLC患者、NSCLC患者和无癌症患者的血浆样本（图1B）。结果显示，该定制靶向测序panel产生了高覆盖率，并鉴定了关键SCLC相关基因的突变，典型SCLC驱动基因TP53有害突变普遍存在，RB1有害突变也非常频繁，SCLC肿瘤抑制因子如KMT2D、NOTCH1/2和CREBBP中反复出现的截短功能丧失突变，以及MYC和MYCL中反复出现的扩增（图1D）。

SCLC倾向于高表达转录因子（TF）ASCL1、NEUROD1、POU2F3和REST，其差异激活定义了分子亚型。根据ASCL1、ATOH1、NEUROD1和POU2F3的表达，揭示了SCLC样本的多种亚型：ASCL1、ASCL1 + NEUROD1、NEUROD1、ATOH1 + NEUROD1、ATOH1、POU2F3和 pan-low（图 1E）。  

图1. cfDNA测序用于整合突变检测和推断肿瘤TF活性和基因表达

02 揭示肿瘤细胞TF活性和基因表达特征

研究人员探究了cfDNA中TFBS的靶向测序能否揭示SCLC和大细胞神经内分泌癌（LCNEC）PDX样本中肿瘤细胞TF活性，在TFBS中生成了cfDNA核小体图谱，并为每个样本中的每个TF生成了单个“复合”cfDNA核小体图谱（图2A）。在所有20个NE PDX样本的靶向cfDNA核小体测序中，TF阳性样本比TF阴性样本中的复合核小体图谱变化更大，相对于侧翼区域，TFBS的覆盖率降低，这与先前的研究一致（图2B）。复合谱的无监督分层聚类通过NEUROD1、POU2F3和REST的TF活性来区分样本（图2C）。

随后，研究人员探究了TSS的靶向cfDNA核小体图谱能否揭示肿瘤细胞基因表达，重点关注了13240个TSS。在20个NE PDX的靶向cfDNA测序中，随着基因表达十分位数的增加，复合TSS cfDNA核小体分布越来越不均匀，这与先前的报道一致（图2D）。此外，单个TSS的高覆盖深度与与基因转录水平呈正相关（图2E）。以上结果表明，TFBS和TSS的高度多重靶向cfDNA核小体图谱忠实地揭示了NE PDX中组织TF活性和基因表达的信号。

图2.靶向cfDNA核小体图谱能够揭示肿瘤细胞TF活性和基因表达特征

03 靶标位点分析保留TF活性和基因表达信号

由于染色质可及性模式在基因位点间存在显著的异质性，因此，为探究单个位点cfDNA核小体图谱的准确评估是否能更敏感地推断TF活性和基因表达，研究人员对推断TF活性（TFBS）或基因表达（TSS）的单个位点做了进一步完善（图3A）。结果发现，cfDNA核小体图谱簇分配和TF活性标记之间具有良好的一致性（图3B），20%的TSS在聚类分配和相关基因的表达之间有很强的相关性（图3C），表明靶向测序可以揭示位点之间相当大的异质性，组织TF活性和基因表达可以通过靶标位点的个体分析来检测。

此外，研究人员考虑到位点之间的异质性，开发了一种方法来解释每个样本中的cfDNA核小体图谱（图3F），发现TSS轮廓形状相似性和基因表达之间具有高度相关性（图3G），包括ASCL1、NEUROD1和POU2F3的TSS等。16个TSS处的轮廓形状相似性度量的分层聚类形成了具有不同SCLC TF活性的四个主要聚类（图3H）。以上结果表明，定制的靶向测序panel包括为TF活性（TFBS）或基因表达（TSS）的推断提供信息的单个位点，对所选位点的单个位点分析可揭示TF活性和单基因表达信号。

图3.对选定的高信息量位点的分析保留了TF活性和基因表达的强信号

04 组织学预测

研究团队验证了靶向cfDNA核小体谱分析是否可以预测肺癌的组织学类型，重点是区分SCLC和NSCLC。为此，研究人员设计了一个分析cfDNA核小体图谱的概率框架，以同时估计患者血浆样本的肿瘤分数和组织学组成，使用PDX样本和非恶性患者样本训练组织学预测模型，并评估了预测性能（图4A-B）。与非恶性患者样本相比，该模型预测PDX样本的肿瘤分数一致较高（图4C），组织学评分也与预期高度一致。在9个NSCLC和70个SCLC患者血浆样本中（图4B）；与NSCLC患者相比，SCLC患者的肿瘤分数高得多（图4F）；SCLC和NSCLC患者样本之间的组织学评分存在显著差异（图4G）。结果表明了靶向cfDNA核小体分析在NSCLC和SCLC非侵入性鉴别中的潜力。

图4.使用靶向cfDNA核小体分析对患者样本进行组织学预测

05 预测SCLC亚型

接下来，为预测关键SCLC TF：ASCL1、NEUROD1、ATOH1、POU2F3和REST的活性，研究人员制定了一个预测模型，联合估计cfDNA肿瘤分数和“TF评分”。结果观察到，在NE PDX样本中，TF得分与TF活性一致。研究人员将模型应用于预测PDX样本中的TF活性，获得ASCL1、NEUROD1、POU2F3和REST各自的AUC为1.0，ATOH1的AUC值为0.875（图5C）。

重新训练模型后，对于ASCL1、NEUROD1和REST，TF阳性患者样本中的TF得分显著高于阴性的患者（图5B）。通过TF活性对患者样本进行分类，ASCL1和NEUROD1的模型AUC分别为0.84和0.88（图5C）。当将模型应用于没有匹配组织的9个NSCLC和46个SCLC患者样本时（图5A），发现ASCL1和NEUROD1的TF得分较高，REST的TF得分较低，与已建立的组织学特异性模式一致。这些结果表明，针对信息丰富分TFBS和TSS的靶向cfDNA核小体分析定制的概率模型可靠地预测了TF活性，从而实现肺癌患者样本的亚型分类。

图5.使用TF活性预测对患者样本进行SCLC亚型推断

综上所述，SCLCpheno-seq是一种利用靶向cfDNA核小体测序推断SCLC亚型，对NSCLC和SCLC组织学进行准确区分的方法。该策略有助于对单个基因组位点的核小体谱模式进行深入研究，也可以与传统的靶向测序无缝集成以进行突变检测。SCLCpheno-seq有望解决肺癌临床护理和研究中的关键难题，例如监测驱动突变阳性NSCLC患者的SCLC转化发展，可以给予患者更及时的治疗并改善结果，具有推进癌症患者研究和护理的潜力。

论文原文：

Hiatt JB, Doebley AL, Arnold HU, et al. Molecular phenotyping of small cell lung cancer using targeted cfDNA profiling of transcriptional regulatory regions. Sci Adv. 2024;10(15):eadk2082. doi:10.1126/sciadv.adk2082

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adk2082

Tags： Sci Adv：基于cfDNA靶向测序的小细胞肺癌分型方法，可无创预测患者的关键肿瘤特征