中风是引发死亡和残疾的主要因素，发病率逐年攀升。血栓引发的缺血性中风占据了中风的大部分比例。目前，急性缺血性卒中患者在发病4.5小时内可接受组织型纤溶酶原激活剂（tPA）介导的溶栓治疗。然而，tPA治疗过程中面临的主要难题是脑微血管渗出和脑出血（CH）。

养血清脑丸（YXQNW）作为一种复方中药，在我国广泛应用于缓解血虚肝亢所导致的头晕、烦躁、失眠、多梦等症。然而，关于YXQNW是否具有抑制tPA处理后血脑屏障损伤所引发的脑微血管渗出及CH的作用，目前尚无明确证据。

一篇名为“YangXueQingNaoWan attenuated blood brain barrier disruption after thrombolysis with tissue plasminogen activator in ischemia stroke”的文章，旨在观察YXQNW对tPA处理后脑微血管渗出和CH的影响，探讨其保护血脑屏障的机制。

图1 论文首页

YXQNW促进tPA处理后小鼠脑血流量(CBF)的恢复

该研究将小鼠分为五组，分别是sham（假手术）组、thrombus（血栓）组, thrombus+YXQNW组, thrombus+tPA组 ，thrombus+tPA+YXQNW组。为探究YXQNW对血流动力学效应的影响，在不同时间点记录脑血流量（CBF）：基线、缺血性脑卒中后10分钟、4.5小时、5.5小时、6.5小时以及28.5小时（图2A）。与假手术组相比，血栓组在缺血后CBF显著降低，血栓+YXQNW、血栓+tPA及血栓+tPA+YXQNW组同样呈现出此现象。YXQNW仅在28.5小时就部分逆转了tPA诱导的CBF减少（图2B）。

图2 YXQNW促进小鼠tPA处理后CBF的恢复

YXQNW改善tPA处理后小鼠梗死体积、存活率、神经功能缺损和步态分析

在缺血性卒中后，研究者通过TTC方法检测脑梗塞（图3A）。血栓组与假手术组相比，梗死灶显著较大。经tPA处理后，损伤加剧。然而，YXQNW显著减轻了tPA导致的梗塞面积增加（图3B）。

随即研究者评估了YXQNW对生存率、神经功能缺损以及步态分析的影响（图3C–J）。血栓组的24小时存活率为75%，但接受tPA治疗后（50%）存活率下降。血栓+tPA+YXQNW组的存活率为68.75%（图3C）。在接受tPA治疗后24小时，研究使用mNSS和NES评分评估神经功能缺损，结果显示，与血栓组相比，tPA组小鼠的mNSS和NES评分显著较差，而YXQNW减轻了tPA诱导的神经功能缺损（图3D–E）。

此外，研究者测量了步态行为以评估YXQNW的效果（图3F–J）。与假手术组相比，缺血动物的前跨步距离较短。tPA的应用加剧了损伤，而YXQNW抑制了这一损伤。血栓和血栓+tPA组小鼠的后爪步宽较假手术组更宽，YXQNW改善了tPA引起的后爪步宽。

图3 YXQNW改善小鼠tPA后的梗死体积、存活率、神经功能缺损和步态分析

YXQNW减少tPA处理后小鼠脑微血管渗出和CH

图4A-B显示，血栓组小鼠仅有少量伊文思蓝渗出物。经tPA溶栓处理后，外渗加重并伴有明显出血，而YXQNW能有效减轻出血。通过评估脑含水量以反映缺血性卒中后脑水肿的程度。与假手术组相比，血栓组小鼠脑含水量增加，但无显著差异。然而，tPA显著加重了脑水肿，而YXQNW则改善了这一状况（图4C）。

（图4D-E）展示了所有组别小鼠脑小静脉的FITC标记的白蛋白渗漏。结果表明，相较于假手术组，脑卒中后白蛋白渗漏显著增加。tPA进一步加重了白蛋白渗漏，而YXQNW则减弱了白蛋白渗漏。出血程度通过血红蛋白测定法进行评估。定量结果显示，在血栓小鼠中，YXQNW抑制了tPA诱导的出血（图4F）。这些结果表明，YXQNW的应用能在一定程度上逆转脑微血管渗出和出血程度。

图4 YXQNW减少tPA处理后小鼠脑微血管渗出和CH

YXQNW抑制小鼠tPA后TJs和AJs的降解和低表达

关于内皮细胞连接在血脑屏障调节中的作用，研究者采用免疫荧光法对闭合蛋白（Occludin）及血管内皮细胞钙黏蛋白（VE-Cadherin）的降解情况进行评估。

免疫染色实验表明，tPA可导致Occludin和VE-Cadherin的不连续性与降解，而这一现象可被YXQNW抑制（图5A）。进一步利用免疫印迹法检测皮质中Occludin、VE-Cadherin、Claudin-5、JAM-1及ZO-1的表达水平。结果显示，相较于假手术组，血栓组中Occludin、Claudin-5、JAM-1及VE-Cadherin的表达水平较低，但除ZO-1外，其余指标差异不显著（图5B–G）。在tPA作用后，连接蛋白的表达降低趋势加剧，而YXQNW可有效阻止此类情况的发生。因此，tPA可降低紧密和粘附连接的表达水平，而YXQNW具有逆转此表达变化的能力。

图5  YXQNW抑制小鼠tPA后TJs和AJs的降解和低表达

YXQNW抑制tPA处理后的小鼠白细胞粘附和巨噬细胞来源的MMP-9活化

经罗丹明6G标记的白细胞粘附在小鼠脑小静脉上的现象在所有实验组中均有出现（图6A-B）。研究结果揭示，相较于假手术组，缺血性脑卒中后白细胞在小静脉壁上的粘附数量显著上升。tPA的治疗进一步加剧了这一趋势，而YXQNW则降低了粘附的白细胞数量。I/R过程引发了基质金属蛋白酶（MMPs）的分泌。双重免疫荧光染色显示，MMP-9主要源自CD18染色的白细胞，特别是CD68标记的巨噬细胞，而非vWF标记的内皮细胞（图6C-D）。此外，YXQNW还能够抑制巨噬细胞分泌MMP-9。

图6 YXQNW抑制小鼠tPA处理后白细胞粘附和巨噬细胞衍生的MMP-9的激活

YXQNW改善小鼠tPA处理后基底膜的降解和低表达

tPA诱导小鼠IV型胶原和层粘连蛋白的降解，而在使用YXQNW后，该降解过程部分受到抑制（图7A）。免疫荧光染色和蛋白质印迹的结果均显示了相同的变化趋势（图7B-E）。Matrix  Metalloproteinases（MMPs）通常导致连接膜和基底膜蛋白的降解，这是慢性高血压（CH）的发病机制之一。免疫印迹实验表明，tPA诱导了MMP-9的表达，而非MMP-2的表达，这一过程被YXQNW所抑制（图7F-H）。

图7 YXQNW改善小鼠tPA处理后基底膜的降解和低表达

结论

研究成果表明，YXQNW具有抑制tPA溶栓后血脑屏障损伤的作用，能够减轻脑微血管渗出和出血的程度。

参考文献：

Yao SQ, Ye Y, Li Q, Wang XY, Yan L, Huo XM, Pan CS, Fu Y, Liu J, Han JY. YangXueQingNaoWan attenuated blood brain barrier disruption after thrombolysis with tissue plasminogen activator in ischemia stroke.J Ethnopharmacol.2024Jan 10;318(Pt B):117024. doi: 10.1016/j.jep.2023.117024. 

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