恶性肿瘤细胞释放到体液中的cfDNA可以用于识别癌症相关生物标志物，以进行疾病诊断和监测。DNA甲基化改变是癌症进展过程中最早发生的分子变化之一，异常的DNA甲基化改变可能是大多数人类肿瘤类型的标志物。为了检测甲基化，cfDNA通常用亚硫酸氢盐处理或将胞嘧啶通过酶促转化为尿嘧啶。但这种方法会引入偏差，例如明显的GC偏好、DNA损伤和PCR扩增偏差。尤其是从血浆中提取的cfDNA产量低，使用传统的测序方法表征患者的cfDNA甲基化组仍然具有挑战性。

来自美国斯坦福大学的研究团队在Genome Medicine上在线发表研究文章“Single-molecule methylation profiles of cell-free DNA in cancer with nanopore sequencing”。该文章介绍了一种纳米孔单分子测序方法，用于有效地表征癌症患者cfDNA的甲基化谱。该方法可以从纳克级或更少量的cfDNA中生成测序文库，对来自癌症患者的单个cfDNA样本产生高达2亿个reads，比现有的纳米孔测序方法提高了一个数量级。基于该策略，研究团队利用Oxford Nanopore平台鉴定了cfDNA甲基化，且无需胞嘧啶转化。与未修饰的DNA相比，甲基化DNA通过纳米孔可产生独特的电信号，获得的甲基化谱直接反映了cfDNA的天然单分子状态。

文章发表在Genome Medicine上

提高纳米孔测序数据产量

纳米孔测序通常需要数百纳克的DNA进行文库制备。但样本提取的cfDNA产量范围为每毫升血浆1毫微克甚至更少。为了能够从纳克级数量的cfDNA中进行无PCR制备文库，研究人员改进了文库构建方案，构建了基于纳米孔的单分子测序策略。与Nanopore标准方案相比，该测序所得的数据产量提高了约一个数量级，即可以使DNA输入量低至100pg（图1B）。

结直肠癌队列中的cfDNA甲基化模式

接下来，研究人员对20名结直肠癌患者的cfDNA进行了测序，每个样本的序列产量范围为1至1.8亿个reads。使用荧光测定法定量每个样本的cfDNA，发现定量结果与总测序产量高度相关（图1C）。作为对照，研究团队对健康个体的cfDNA进行了测序。当比较健康和癌症患者的cfDNA时，存在显著的差异。癌症患者cfDNA样本中全基因组甲基化总体差异高于7%，健康个体cfDNA样本的甲基化总体差异低于2%。

随后，研究人员试图确定癌症患者和健康对照之间的cfDNA片段大小分布是否有统计学上的显著变化，使用250bp的片段大小值区分单核小体和双核小体片段。结果表明，与健康对照相比，癌症患者cfDNA在单核小体中的富集约高两倍。同时，两组个体的多个基因的甲基化水平存在显著差异（图1）。与癌症患者的cfDNA相比，健康cfDNA样本中的cfDNA甲基相对一致。

图1. cfDNA的纳米孔测序。

cfDNA测序reads的单分子分类

研究人员确定了来自cfDNA测序数据的单个reads是否能归类为来自肿瘤或免疫细胞。研究人员从匹配样本中提取DNA进行纳米孔测序和甲基化分析，包括切除肿瘤、外周白细胞和治疗期间采集的血液样本。为了对每个reads进行分类，研究人员根据基因组坐标和甲基化状态计算了匹配甲基化位点的比例，并与匹配的肿瘤或免疫细胞甲基化谱进行了比较。

研究人员使用健康人的消化PBMC核小体和癌细胞系验证了上述方法，核小体DNA进行高深度纳米孔测序和甲基化检测（图2B），检测结果可以达到97%的灵敏度和93%的特异性，AUC为0.95。

图2. 结直肠癌患者的单分子甲基化测序分类。

纳米孔测序肿瘤负荷的纵向评估

研究团队分析了来自三名患有不同胃肠道癌症患者（P4822、P6199、P6527）的纵向血液cfDNA样本，包括对患者匹配的肿瘤、外周血和纵向血浆样本进行纳米孔测序，并确定甲基化谱。匹配的肿瘤和免疫细胞测序达到28×覆盖，每个患者产生数千万个CpG位点。甲基化谱揭示了患者对特定治疗的反应和治疗耐药转移性癌症的出现。

对于一名接受治疗的转移性结直肠癌患者（P6199），研究人员在大约600天内采集了血液样本（图2D）。患者经过化疗和手术后，病情稳定，但从第400天开始，具有肿瘤特异性甲基化变化的reads比例显著增加。这种变化与CT成像相照应，CT成像显示多个器官的实质性转移进展。

研究人员利用该方案对另外两名转移性癌症患者进行了分析。1例患者（P4822）患有转移性胰腺神经内分泌癌，并接受了靶向治疗、放疗和肽受体放射性核素治疗（PRRT）多种治疗，时间跨度超过1000天（图3A）。每次治疗后，治疗效果与肿瘤特异性reads下降之间存在相关性。新转移的出现反映在肿瘤特异性甲基化变化的reads增加。与患者P6199类似，该患者其多种临床事件的肿瘤特异性reads的增加与部分基因甲基化变化相关（图3B）。对于另一例转移性胆管癌患者（P6527），对吉西他滨初始化疗的耐药性明显，但在双重化疗下疾病减轻（图3C）。在开始治疗100天时发生疾病进展，并通过肿瘤特异性reads计数和肿瘤特异性基因水平甲基化的变化得到证实（图3D）。该患者接受了原发性肿瘤和肝转移的广泛手术切除，是的使得肿瘤特异性reads的立即下降上，随后肿瘤特异性reads的增加与转移性癌症复发相吻合。

图3. 其他恶性肿瘤中患者来源cfDNA的纵向甲基化谱。

cfDNA的表观遗传学表征是一种检测和表征癌症等疾病的新兴方法，表征癌症特异性甲基化变化已被证明是液体活检的一种高度敏感和特异的方式。研究人员开发了一种基于纳米孔的单分子测序方法来检测cfDNA甲基化组，无需PCR扩增，并可用于小cfDNA片段测序。与短读测序相比，该方法实验步骤和瓶颈明显减少，对来自癌症患者的单个cfDNA样本可产生高达2亿的reads，比现有的纳米孔测序方法提高了一个数量级，使得从不到1毫升的血浆中获得稳定的测序产量成为可能。研究团队检测了具有明显表观遗传特征的癌症相关甲基化谱，并提供了与临床事件相对应的肿瘤负荷。该研究显示了对大规模cfDNA队列进行纳米孔测序的潜力，有可能在癌症筛查领域实现新的应用。

参考资料：

Lau, B. T., Almeda, A., Schauer, M., McNamara, M., Bai, X., Meng, Q., ... & Ji, H. P. (2023). Single-molecule methylation profiles of cell-free DNA in cancer with nanopore sequencing. Genome Medicine, 15(1), 1-13.

https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073-023-01178-3

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