Hey guys，细菌生物膜已被研究为注射填充剂治疗后不良结节反应的可能原因。由于有各种不同化学性质的填充剂，本研究的作者试图对三类填充剂支持生物膜生长的倾向进行体外分析。此外，作者试图设计一个模拟针头进入真皮的过程，以研究填充材料通过被细菌污染的表面接种的效果。作者还试图分析注射填充剂后18个月内出现慢性肉芽肿性炎症的患者的样本。检查这些临床样本是否存在生物膜，并对细菌群落物种分布（微生物组）进行表征。

材料和方法

体外研究包括三种填充材料：透明质酸、聚丙烯酰胺凝胶和聚左旋乳酸。体外模型测试填充剂在存在或不存在额外营养的情况下促进生物膜形成的能力，以模拟体内条件，代表填充剂和组织之间的界面（获得营养）和填充剂中心（无营养）。制备在无营养组的磷酸盐缓冲盐水中或在营养组的100%胰蛋白酶大豆肉汤中稀释至104个菌落形成单位/ml的表皮葡萄球菌（ATCC 35984）。将0.2毫升等分的每种填充剂（透明质酸、聚丙烯酰胺凝胶和聚左旋乳酸）或100毫升磷酸盐缓冲盐水（对照）沉积在具有胶原骨架的玻璃试片上，并放置在六孔组织培养板上。然后用0.1 ml含有103个集落形成单位/ml表皮葡萄球菌的培养物接种每个填充剂，并将板在37°C下孵育16小时。培养后，对孔进行超声处理，并通过连续10倍稀释和标准平板培养来确定感染每个填充剂的细菌数量。每个条件重复20次。

图：迟发型红肿

根据制造商的说明，用LIVE/DEAD BacLight 7012活力染色剂（Molecular Probes，Invitrogen，Mulgrave，Victoria，Australia）对其他样品进行染色，并如前所述通过共焦激光扫描显微镜检查。通过Imaris 7.7.2软件用0.2µm光学切片构建三维图像（Bitplane，Zurich，Switzerland）使用Berk等人描述的方法。如前所述，通过扫描电子显微镜目视确认生物膜的存在。

将6孔组织培养板的孔填充3 ml稀营养琼脂（0.5%）。然后将开放的板放置在无菌外科手套内，并将手套紧紧固定。用100µl含有104表皮葡萄球菌的胰蛋白酶大豆肉汤接种覆盖每个孔的手套区域，并使其干燥4小时。然后使用23号皮下注射针通过接种的手套区域将总共1ml透明质酸填充剂注射到下面的琼脂中。对于单次注射，将1ml填充剂作为团块注射。对于多次注射，通过手套将10次0.1ml填充剂接种到稀琼脂中。每种情况重复17次。然后将平板在37°C下孵育过夜，并如上所述测定集落形成单位计数。

图：迟发型红肿

人类研究的伦理批准已获得麦格理大学的批准。从2013年1月开始，在18个月的时间里，为接受我们临床服务的患者注射可降解或半永久性填充剂后，通过开放式活检从慢性肉芽肿性炎症区域获得样本。标本被送往商业实验室进行常规组织病理学、显微镜检查和培养，并在麦考瑞大学进行生物膜分析。生物膜分析如前所述，通过16s rRNA基因和18s rNA基因拷贝数的实时定量聚合酶链式反应测定临床样本的细菌总数。

细菌总数是基于人体组织中18s rRNA的平均拷贝数表达的每毫克组织。荧光原位杂交和扫描电子显微镜填充剂样品中的细菌聚集体通过荧光原位杂交进行检测和定位，使用通用细菌和表皮葡萄球菌物种探针（Life Technologies，Carlsbad，CA），如Thurnher等人所述。通过固定和脱水制备用于扫描电子显微镜的临床样品，如上文所述。

结果

商业填充剂体外细菌生长的比较所有三种填充剂（即透明质酸、聚左旋乳酸和聚丙烯酰胺凝胶）在存在和不存在胰蛋白酶大豆肉汤的情况下都支持表皮葡萄球菌的生长。在缺乏营养的情况下，透明质酸填充剂样品上的细菌生长明显大于聚左旋乳酸、聚丙烯酰胺凝胶，与对照组相比（p＜0.05）。聚左旋乳酸填充剂样品的细菌生长大于聚丙烯酰胺凝胶和对照组（p＜0.01）。聚丙烯酰胺凝胶填充剂样品与对照基质的细菌生长没有差异。当添加额外的营养时，所有三种填充剂和大鼠尾胶原上的细菌生长增加了104到108倍（p＜0.001）（图1）。

图1

在有营养的情况下，聚丙烯酰胺凝胶比聚左旋乳酸、透明质酸或大鼠尾胶原支持更多的生长（p<0.05）。透明质酸的生长量明显高于聚左旋乳酸（p<0.05），但不高于大鼠尾胶原。在有营养的情况下，聚左旋乳酸上生长的细菌比大鼠尾胶原上生长的更少，但这并不显著。扫描电子显微镜直观地证实了接种的透明质酸样品上存在生物膜。透明质酸填充剂的开窗内可见细菌。在聚丙烯酰胺凝胶样品上也可以看到细菌附着和生物膜形成。扫描电子显微镜没有检测到细菌在聚左旋乳酸填充剂上的生长或附着。

共聚焦显微镜和三维分析证明了透明质酸填充剂中细菌的生长和生物膜的形成（图2）；同样，在含有营养成分的聚丙烯酰胺凝胶样品的共聚焦显微镜下，检测了细菌的生长和与聚丙烯酰胺凝胶涂层的附着。

图2

多次注射对填充剂污染的影响：通过受污染的膜多次注射填充剂导致感染多次针道填充剂的细菌数量（平均7.3×1010菌落形成单位/ml）比单次注射填充剂（平均5.9×106菌落形成单位/ml）高10000倍（p<0.005）（图3）。

图3

临床样品的生物膜特征：从五名有慢性肉芽肿性炎症证据的患者身上获得六个组织样本，这些患者在首次注射各种填充剂后平均7年，包括Dermalive[透明质酸与丙烯酸水凝胶的组合（Dermatch；法国巴黎SARL）]、聚丙烯酰胺（Aquamid；Contura，Seoborg，丹麦）、聚左旋乳酸（Sculptra；Galderma，洛桑，瑞士）和透明质酸（Juvéderm Voluma/Vycross；Allergan，都柏林，爱尔兰）（图4）。

图4

表1总结了患者的临床信息。从第一次注射到炎症发作的平均时间为5年。在此期间，所有患者每隔8至12个月接受多次治疗。所有患者都接受了多个疗程的口服抗生素治疗，三名患者（患者1、4和5）尝试了经皮穿刺和/或手术引流感染。在三个新鲜标本中，一个标本长出铜绿假单胞菌，另一个标本生长出表皮葡萄球菌和轻度链球菌。一个标本为培养阴性。常规组织学（苏木精和伊红）染色显示，所有标本均形成异物肉芽肿，具有典型特征，包括多核巨细胞。填充剂也存在。16S rRNA定量聚合酶链式反应在所有标本中检测到大量细菌，平均为2.2×107个细菌/mg组织（范围为5.6×105至3.7×107个菌/mg组织）。

表1

在扫描电子显微镜和荧光原位杂交上，所有样品中的生物膜都可见（图5）。微生物组分析证实了多物种生物膜，假单胞菌和其他口腔内和皮肤菌群总体上占主导地位（图6）。在所有六个样本中都发现了荧光假单胞菌，占微生物群的20%至34%。然而，米氏假单胞菌是在患者3中发现的主要细菌，它形成了67%的生物膜（图7）。铜绿假单胞菌仅在患者2的样本中发现，尽管对该生物培养呈阳性，但它仅占微生物组的3%。形成5%或更多生物膜的其他常见器官包括轻度链球菌、唾液酸链球菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、不动杆菌属、壳核草螺旋杆菌、尖刺雷氏菌和不动杆菌（图7）。大多数细菌是好氧或兼性好氧的，不到10%的微生物组由厌氧生物组成，主要是痤疮丙酸杆菌。

讨论

软组织填充剂在化妆品和其他应用中的广泛使用导致注射后长期不良反应的报告数量增加。注射部位的慢性炎症表现为持续的肿块、结节，肉芽肿形成和/或引流窦和感染正被认为是一个难以治疗的重要临床问题。随着实验室检测的进步，细菌生物膜已被确定为导致与填充剂注射相关的慢性感染和肉芽肿的可能罪魁祸首。这反映了更广泛的文献，这些文献已将生物膜感染确立为各种医疗器械和植入物中器械相关感染的主要原因。

图5

填充剂应在概念上被视为医疗器械，因为它们是插入患者体内的异物，因此它们也有细菌生物膜污染及其后续后果的风险也就不足为奇了。Christensen等人首次在注射填充剂后出现慢性肉芽肿反应的患者的组织活检标本中显示出细菌感染。Bjarnholt等人随后又从注射聚丙烯酰胺后的肉芽肿患者身上采集了一系列生物膜阳性活检标本。Christensen等人在一项比较研究中，研究表明，来自聚丙烯酰胺凝胶注射后的慢性肉芽肿性炎症患者的98%的样本具有细菌生长，而对照样本的细菌生长率为0%。

作者的研究表明，填充剂可以在体外支持生物膜的形成。这些数据表明，在缺乏额外营养的情况下，透明质酸、聚左旋乳酸和聚丙烯酰胺凝胶都支持细菌在体外生长。添加胰蛋白酶大豆肉汤作为额外营养是为了模拟体液和蛋白质作为营养来源的生物条件。提供营养显著促进了所有填充剂上细菌的生长。对于聚丙烯酰胺凝胶和透明质酸填充剂，扫描电子显微镜和共聚焦显微镜证实了已建立的生物膜的存在。尽管聚左旋乳酸支持细菌的生长，但生物膜无法通过成像进行视觉确认。这与已报道的文献一致，在文献中，与透明质酸或聚丙烯酰胺凝胶相比，聚左旋乳酸与晚发性肉芽肿的形成频率没有那么高。可能是因为聚左旋乳酸的生物相容性和降解特性，不太可能支持生物膜。聚左旋乳酸刺激成纤维细胞活性和胶原蛋白的产生，从而使真皮增厚，然后通过巨噬细胞的水解、溶解和吞噬作用迅速降解和去除。降解过程产生酸性降解产物（即乳酸），可降低局部环境的pH值，从而限制了细菌的存活。

图6

尽管透明质酸具有与聚左旋乳酸相似的快速降解特性，但它是唯一一种细菌侵入基质的填充剂。最近的一项研究表明，在400名患者中，高达4.25%的患者经历了长期和复发的炎症性皮肤损伤，这表明透明质酸给药后发生不良事件的风险高于之前报道的风险。慢性肉芽肿性炎症患者的所有六个临床标本中都证实了生物膜的存在，假单胞菌与其他多种口腔内和皮肤共生菌一起被鉴定为优势属。尽管这些物种中的许多通常与感染无关，但在存在异物的情况下，它们有可能导致持续感染。这些发现反映在先前的研究中。依赖包括拭子和平板培养在内的标准微生物学技术可能会对细菌污染的存在产生假阴性结果。这被认为是由于生物膜细菌的低代谢率。相比之下，作者的研究使用了各种实验室方法来确认是否存在活的生物膜细菌。微生物组分析与先前在临床样本中发现的假单胞菌、表皮葡萄球菌和痤疮假单胞菌的结果一致。Alhede等人报道了一项有趣的小鼠研究，该研究表明，在将透明质酸、聚丙烯酰胺凝胶、聚左旋乳酸和羟基磷灰石钙微球注射到真皮袋中后，假单胞菌、葡萄球菌和丙酸杆菌都被培养。他们的研究结果还表明，一旦建立了生物膜感染，用高剂量抗生素治疗就无法根除感染。

图7

在体外多次穿过细菌草坪导致的更高污染凸显了注射软组织填充剂时适当无菌技术（以减少初始细菌负荷）和使用最小穿过皮肤（被细菌严重污染）的重要性。人类皮肤的污染水平在102至106个生物体/cm²之间，主要物种为表皮葡萄球菌。本研究的体外模型试图使用分布在9 cm²内的104种生物体来近似皮肤细菌负荷，尽管生物膜是单物种的，并且不考虑身体不同部位的表面污染的可变性。然而，尽管有其局限性，该模型已经证实，用针多次穿过受污染的表面会导致注射的填充剂团受到明显更高的污染。与乳房植入物一样，在部署时注意将污染风险降至最低，可以潜在地显著降低晚期并发症的风险。这项研究支持了生物膜可能是填充剂注射后慢性肉芽肿性炎症的原因的假设，并强调了正在进行的研究的必要性，以确定风险因素和预防污染的技术注射时。除了仔细的患者选择和细致的技术外，未来改变软组织填充剂降解时间、表面纹理和孔径的研究可能会降低细菌定植和污染的风险。此外，与填充剂结合的抗菌药物作为联合药物递送机制的递送也可以提供中长期的抗感染保护。

参考文献

1. Saththianathan M, Johani K, Taylor A, Hu H, Vickery K, Callan P, Deva AK. The Role of Bacterial Biofilm in Adverse Soft-Tissue Filler Reactions: A Combined Laboratory and Clinical Study. Plast Reconstr Surg. 2017 Mar;139(3):613-621. doi: 10.1097/PRS.0000000000003067. PMID: 28234833.

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