随着对多发性骨髓瘤（MM）遗传风险因素认识的不断深入，二代测序（NGS）的使用越来越普遍，关于是否可以在诊断时补充甚至取代荧光原位杂交（FISH），可能仍有争议。

欧洲骨髓瘤网络（EMN）的临床和实验室小组通过结构化的共识流程，就NGS在MM风险评估中的常规临床应用提出了共识建议，解决了四个关键问题：（1）在识别预后遗传标志物方面，应使用NGS作为FISH的补充还是替代；（2）哪些预后标志物与NGS分析最相关；（3）哪些患者应接受NGS检测；（4）进行NGS的最佳时机是什么。

专家组评估了可用的NGS技术，将其性能与基于FISH的方法进行了比较，并回顾了当前标准的NGS方案、质量控制措施，为在MM中实施NGS诊断提供了实用要点。该共识声明近日发表于《HemaSphere》。

引言

多发性骨髓瘤（MM）是一种浆细胞（PC）肿瘤，源于生发中心成熟B淋巴细胞中获得的遗传异常，其起始遗传事件分为两类，它们大多相互排斥（但并非普遍如此）。第一类包括复发性癌基因易位至染色体（chr）14q32上的免疫球蛋白重链（IGH）位点：chr11上的CCND1、chr4上的NSD2（有时是FGFR3）、chr16上的MAF、chr6上的CCND3、chr20上的MAFB。第二类是高倍体性，包括至少两个奇数染色体（3、5、7、9、11、15、19和21）的三体性。

获得这些起始事件后，生发中心后B细胞继续分化为PC，迁移至骨髓（BM），并保留正常PC的许多功能特性。这些包括抗体分泌和与微环境的相互作用，因此MM的标志（对应于其诊断标准）是血清中（有时在尿液中）存在单克隆蛋白（MP）以及BM中PC过多。

在某些患者中，还可能识别出循环PC（cPCs）并具有预后价值。重要的是，多项证据表明，从B细胞初始转化到血清中出现可识别的MP之间，经过的时间长达数十年而非数年。在此期间，进展性病例将获得继发性遗传异常，即基因突变、肿瘤抑制基因周围的染色体缺失、进一步的三体性（统称为拷贝数异常，CNA）和其他结构变异。

总体而言，在临床前进化过程中获得的异常构成了MM基因组，其特征自二代测序（NGS）技术出现以来已被详细描述。结构变异、CNA、插入缺失和单核苷酸变异构成主要的驱动基因组异常，每位MM患者平均携带五到六个，正如靶向数据所示。

最近，通过全基因组测序（WGS），具有致病性和/或预后意义的驱动变异目录已显著扩展，并且未来可能进一步增长。NGS揭示的这种粒度水平可用于分类目的：识别起始遗传事件和主要的MM亚组，并且这些亚组可以根据是否存在继发性遗传事件进一步细分。然而，虽然这种“基因组分类”仅反映MM发展和基因组组成的实际生物学，其预后价值很小。

有证据表明，通过RNA表达分析可以进一步完善基因组MM分类，但不太可能在常规临床使用中广泛采纳。相反，新诊断MM（NDMM）中最紧迫的问题之一是能否预测患者对治疗的反应和/或生存期，以及通过哪些因素预测。

虽然最初基于实验室值（例如国际分期系统[ISS]），但近期的风险分期系统要求通过荧光原位杂交（FISH）在从BM纯化的CD138⁺ PC中识别高危（HR）细胞遗传学异常。特别是，若患者为ISS III期并且携带t(4;14)、t(14;16)、del(17p)，或乳酸脱氢酶升高，则修订版ISS（R-ISS）将患者分类为HR。

在最新的修订版R2-ISS中，t(14;16)易位已被剔除，并增加了chr1q的获得/扩增。此外，在R2-ISS中，风险分层是加权的，意味着患者首先不需要是ISS III期才能基于遗传特征被分层为HR。

此外还存在其他风险评分。许多评分仅使用上述遗传异常的不同组合，而其他评分则关注额外的标志物，例如赋予更好预后的chr5获得。

随着这些进展，FISH也常规用于NDMM患者以分层预后，但也经常用于识别预测性反应标志物，例如t(11;14)的存在。虽然t(11;14)表示标准预后，但它也是对维奈克拉或其他BCL2抑制剂反应的强大预测标志物，从而为此类患者增加了可能的治疗选择。为了涵盖预后和预测标志物，大多数NDMM患者因此至少需要使用5-6个FISH探针进行检测。然而，重要的是要注意，由于技术限制，如细胞产量不足、样本质量差或PC纯化方面的挑战（尤其是在低肿瘤负荷病例中），并非100%的患者都能进行FISH检测。

旧的和新的证据都表明，NDMM中的预后和预测因素超出了上述染色体异常，并且无法被FISH捕获。最显著的额外异常是TP53基因突变：通常与del(17p)共存，但也可以单独发现，并且也带来不良预后。此外，MM在诊断时即具有异质性，并且由于克隆演变，其基因组结构在复发时可能发生巨大变化。

此外，针对细胞表面靶点BCMA、GPRC5D和FCRH5的新型T细胞重定向免疫疗法具有前所未有的疗效。最近的证据表明，至少对于前两个靶点，获得性耐药可能至少部分是由抗原逃逸介导的，表明在考虑使用另一种BCMA或GPRC5D靶向疗法再次治疗时，对BCMA和GPRC5D位点进行测序可能具有很高的预测潜力，至少在复发难治性（RRMM）阶段如此。

总而言之，这些证据表明，对MM进行更深入的基因组表征是改善MM患者预后和治疗反应预测的理想选择。国际骨髓瘤学会最近也发表了一份共识文件，阐述了当代需要扩展IGH易位、CNA和TP53突变列表来准确预测MM预后，而NGS是实现这一结果的首选方法（高危多发性骨髓瘤新定义！来自IMS/IMWG的共识建议）。

实际上，与基于FISH和聚合酶链反应（PCR）的传统方法相比，基于NGS的分析可能更适合覆盖更大范围的染色体异常和基因序列。NGS在所需DNA量更少、可扩展性更高、流程简化、成本以及提供信息更丰富方面具有明显优势。

此外，许多中心已经常规对其他血液恶性肿瘤进行NGS检测，如急性髓系白血病（AML）。其中大多数将能够利用其分子实验室的基础设施来实施MM的NGS检测。然而，MM样本的分析需要专门的生物信息学流程，特别是为了识别CNA和易位，这些是大多数AML NGS panel所不能捕获的。NGS的标准化程度也低得多，以至于可以预见其在MM常规诊断中更广泛采用会遇到一些阻力。

本文回顾了关于NGS性能的当前证据，特别是与FISH的比较，涉及MM临床级诊断中的预后和预测能力。基于当前生物学和临床知识的背景，EMN专家小组提供了一份共识声明和实用建议，以促进NGS在临床试验之外的NDMM中与FISH一起或作为替代的更广泛采用，并展望了未来可能的视角。

方法学

采用德尔菲法就NGS在MM常规临床诊断中的使用达成共识。在2024年11月于意大利巴韦诺举行的EMN试验专家会议上，EMN专家组根据临床相关性标准选出了关键问题。每位专家独立回答，并提供有依据的建议。随后采用多步骤流程就建议达成共识：一位专家为每个关键问题起草了一份共识声明，总结了专家们的意见。随后，该共识再次由所有专家评估，他们同意该声明或表达意见并建议修改。若修改，则将起草新的共识并再次由所有专家评审。停止标准设定为至少80%的专家组成员达成共识。

当前在MM临床级诊断中实施NGS的策略

关于NGS用于MM基因组表征有不同方法，其临床验证程度各不相同。大多数面向临床的研究基于靶向DNA测序，在目标和所选靶区域方面存在差异。大多数努力旨在在一个panel中编录基因突变、CNA和IGH易位。

就基因突变而言，一些“简化论”方法仅靶向骨髓瘤中最常见的六种突变，而其他方法则靶向超过200个基因。验证工作表明靶向NGS与WGS或数字PCR（ddPCR）之间的等位基因变异频率具有高度一致性（分别为 R²= 0.90和 R²= 0.98）。

CNA也可以通过其他方式进行筛查。通过NGS，可以通过使用均匀分布在整个基因组中的单核苷酸多态性（SNP）探针来检测CNA：因此可基于其覆盖度与同一样本中二倍体区域的覆盖度进行比较来检测CNA，并且还可以追踪该区域内SNP的接合性，以提高CNA检测的灵敏度，甚至是拷贝数中性杂合性缺失（LOH）事件。为了提高复发性CNA小区域的灵敏度，可以在这些区域更密集地铺设探针，和/或可以利用通常受CNA影响的基因的外显子足迹。使用这种方法，与金标准方法（如跨22个复发性CNA区域的多重连接依赖性探针扩增）相比，一个NGS panel的灵敏度为94.89%，特异性为99.68%。

另一种方法可以是分离NGS工作流程，并从同一样本生成第二个文库用于超低深度全基因组测序（ULP-WGS）：这是一种检测全基因组CNA的更便宜的方法，尽管由于文库制备和分析流程的重复，从技术角度来看更为繁琐。此外，据报道，对于亚克隆病变和小缺失的灵敏度较低。

作为一个更具吸引力的选择，可以利用捕获本身产生的映射到脱靶区域的读段来实现此目的。它们的随机分布产生事实上的全基因组浅层测序，可提供足够的信号来可靠地检测CNA，同时减少了panel的靶标尺寸，但可使用单一、准确的分析工作流程，灵敏度和特异性分别为87.8%和98.4%。

NGS在MM应用中最重要的方面之一在于，其检测涉及免疫球蛋白基因易位的能力。为了检测MM相关的IGH易位，挑战在于有效覆盖位于染色体14q32上的IGH位点。每个B细胞（因此每个MM克隆）在其发育过程中经历广泛的重排以产生抗体多样性。这些重排包括广泛的缺失、核苷酸插入和点突变，这些突变产生与位点的种系状态非常不同的细胞特异性序列，所有这些都发生在高度重复区域的背景下。因此，该区域不太适合用反互补探针进行捕获，这些探针只能围绕位点的种系状态设计。此外，由于相同的原因，将捕获区域映射回种系基因组参考也具有挑战性。为了识别IGH易位，最常用的方法依赖于全面靶向整个IGH位点。使用这种方法，与WGS相比的准确度为100%。有趣的是，与FISH相比，NGS的表现显然较差，在92名患者中灵敏度为94.92%，特异性为87.88%。然而，NGS捕获了6个FISH未能识别的IGH易位。

替代方法靶向来自先前测序工作的染色体断点最常涉及的IGH区域，以减少捕获panel的尺寸并提高其效率。在一种这样的方法中，NGS检测法检测IGH易位的灵敏度和特异性对于44个事件分别为88.6%和99.5%。

无论哪种方式，所有方法都只靶向IGH区域，从未靶向伙伴染色体区域。这是因为，通过双末端测序，至少有一些读段会跨越断点，并在14号染色体和其中一个复发性伙伴染色体上显示不一致的映射，从而消除了对易位两端区域进行测序的需要。这显著减少了panel的足迹，并允许无偏地识别事件中涉及的任何癌基因。一个显著的例外是涉及MYC的t(8;14)(q24;q32)易位，其极为难以靶向。这是因为MYC位点很大（0.5兆碱基），chr8上的断点可能跨越距离该基因数百万碱基的区域，并且IGH断点的特征不太清楚，可能不同于上述IGH易位中涉及的断点。此外，MYC也可能易位到IGK或IGL区域，需要使用更大的panel。因此，由于技术限制和缺乏明确界定的预后价值，尽管MYC具有已知的致病作用，但其易位很少使用NGS panel进行评估。

有人提出了一种根本不同的方法，将WGS和RNA-seq结合起来，以提高MM中NGS分析与FISH相比的灵敏度和稳健性。该研究显示，对于IGH易位，与FISH的一致性为96%，对于CNA的一致性为92%。与靶向panel相比，使用WGS可以检测到更高比例的MYC易位，而RNA-seq则可正确分类IGH易位患者并将其划分为经典的分子亚组。尽管在发表时需要大量的起始DNA（1 µg）和高测序成本，但该程序足够灵敏，可以认为在临床环境中是可靠的。

总体而言，上述证据凸显了全基因组方法在单次实验中提供临床患者管理所需数据的潜力，同时也为研究目的提供了宝贵的信息。

EMN关于在MM中使用NGS的建议

您是否支持使用NGS作为FISH的替代方案，或作为FISH的补充，用于NDMM的预后判断？

EMN专家一致同意NGS在为NDMM预后判断提供的基因组信息方面具有附加价值，并认为NGS应进入常规的临床级诊断。这样做最直接的好处是能够对TP53基因进行基因分型，并且在识别突变的情况下，捕获额外的预后不良风险因素。虽然TP53突变也可以通过常规PCR和测序检测，但所有专家一致认为NGS是进行此分析的首选方法。NGS的另一个好处是提供一个“一步式”解决方案，通过同时提供复发性IGH易位和CNA的信息来评估每个患者的个体风险，从而取代FISH分析。关于如何实施，大多数专家建议开始将NGS作为FISH的补充使用，而少数专家建议NGS可以立即取代FISH。阻碍NGS立即取代FISH的问题包括缺乏标准化、缺乏可及性以及成本/国家特定的报销问题。

因此，EMN专家的建议是，在可获得NGS的实验室/国家开始使用NGS，至少用于TP53突变的分析。然而，专家建议NGS panel的设计应同时能够潜在地捕获CNA和IGH易位，即del(1p)、gain/amp(1q)、del(17p)、t(4;14)和t(14;16)。后一项分析最初可以补充FISH，以允许实验室对NGS方法进行内部验证。从长远来看，只要进行了充分的验证和标准化，基于可及性，NGS可以取代FISH用于常规临床诊断。

NGS panel应仅覆盖当前的预后标志物（即R2-ISS、国际骨髓瘤学会标准），还是您也希望了解潜在的未来反应生物标志物（例如t(11;14)、全基因组CNA和BCMA突变）？

专家一致建议，临床级NGS诊断的设计应覆盖当前使用的风险因素，即使开始时会与FISH一起使用。然而，专家也一致认为，NGS相对于FISH的一个明确附加价值在于可提供关于当前使用的风险分期系统之外具有临床作用的额外预后/预测标志物的信息。虽然目前没有此类经过验证的标志物，但专家建议还应通过NGS研究一组有限的额外改变，包括以下内容：BCMA和GPRC5D的双等位/单等位基因缺失和突变，作为对T细胞重定向疗法反应的预测标志物；BRAF作为有限骨髓瘤患者群体中的可药物靶点；t(11;14)，以识别可能适合BCL2抑制治疗的患者。

展望未来，NDMM中可能会识别出新的预后或预测标志物，这些标志物可能被纳入未来版本的NGS基因panel中。

您会在每位诊断患者中使用此panel，还是仅用于特定亚类？

大多数专家认为，该panel应用于所有NDMM患者，只要预后信息可能指导治疗决策。显然，仅部分患者的治疗决策会根据患者风险而改变：符合当前或未来HR NDMM临床试验/治疗条件的患者；体能状态足够好以接受强化治疗的患者；体能状态较差的患者，如果存在提示对特定疗法敏感或耐药的特定异常。此外，虽然了解每位患者的预后具有明确的附加价值，但对于非常高龄的患者，即年龄超出用于构建预后评分本身的研究上限的患者，或者那些治疗决策不会受NGS结果影响的患者，风险分层可能不准确或总体上信息量不大。因此，专家建议不要在非常高龄/虚弱的患者中进行该检测，类似于FISH的建议。

总体而言，专家建议，在目前为临床级预后判断进行FISH检测的NDMM患者中使用NGS panel。

您会在复发时重复检测吗？

大多数专家认为，对于接受积极治疗的复发患者，应重复进行检测，特别是如果接受T细胞重定向疗法或BCL2抑制治疗（如维奈克拉）的患者。良好的临床实践已经建议在RRMM中重复进行FISH检测，仅限于继发性异常（即del(1p)、gain/amp(1q)和del(17p)）。类似地，未来的NGS方法也应在这些患者中再次进行。为此，如上所述，NGSpanel 应涵盖上述异常，包括TP53基因以及当前（即BCMA、GPRC5D）和未来的CAR-T和双特异性抗体靶点，因为双等位基因缺失，或单等位基因缺失加突变，可能预测耐药。

新型T细胞重定向疗法极其昂贵，经过适当验证，NGS可以成为一种精准医学工具，确保治疗仅施用于可能的应答者。

因此，专家的建议是，在复发且适合接受CAR-T、T细胞重定向疗法、抗体-药物偶联物或BCL2抑制剂积极治疗的患者中，以及通常在体能状态足够好以接受强化治疗且会进行FISH以指导临床决策的患者中，进行NGS检测（需考虑费用和报销问题）（图1）。

MM中NGS分析的实践问题

设计NGS panel 的关键挑战在于平衡panel的靶标大小与其可控性和成本，同时考虑DNA的可用性和数据分析所需的工作量，旨在单次检测中捕获所有疾病相关的关键基因组信息。EMN实验室联盟的成员被要求就如何实际实施基于NGS的MM预后诊断测试的设计和分析提供建议（图2）。

目前而言，NGS应在来自CD138纯化的BM PC的基因组DNA上进行。由于这也是FISH研究的起始材料，在某些情况下，细胞数量可能是一个限制因素。虽然最初在这种情况下应优先进行FISH，但未来，NGS研究所需细胞量较少可能会消除这个问题。

共识在于，目前MM中基于NGS的诊断工作应基于通过杂交捕获使用反义探针进行的靶向pull-down方法。这种方法可确保设计的最大灵活性，并降低测序、分析和存储成本。如上所述，靶区域的设计应允许分析复发性基因突变、复发性CNA和复发性IGH易位。

抑癌基因应靶向其整个编码序列，而癌基因可以仅靶向热点，尽管这样做的成本效益值得怀疑，因此联盟的大多数成员更倾向于对NGS panel中所有基因的整个编码区进行测序。CNA的检测可以根据上述不同策略进行。虽然每种方法都是合理的并且可以无特定问题地使用，但似乎更倾向于依赖脱靶读段进行CNA调用。该方法可确保最小的靶区域、最少的样本制备手动时间，并且仍能返回高度准确的数据。

复发性IGH易位的检测可能更具挑战性，这是由于IGH位点的重复性质以及伙伴染色体中断点的广泛范围。如果靶向整个IGH区域，应通过严格屏蔽避免重复区域。未能这样做将大大增加脱靶测序，并且无论如何也不允许对额外区域进行高质量映射。此外，IGH易位断点聚集在IGH位点的有限区段，靶向整个区域不太可能提高诊断率。建议是仅靶向热点区域，同时根据已测序的数千个样本创建并持续更新此类位置的目录，以改进NGS panel的设计。这种方法在最近的研究中被证明非常准确。由于伙伴染色体中断点位置的变异性，建议仅靶向易位的IGH侧，并依赖不一致映射的读段来识别易位伙伴。

测序应在允许双末端测序的NGS仪器上进行，平均靶标深度至少为200×。达到此覆盖深度所需的千兆碱基数应根据捕获区域的大小计算，考虑预测或计算出的靶标捕获效率，并计入小误差范围。

在按照标准实践进行读段质量控、比对和去除PCR重复后，可以使用几种算法来识别体细胞事件。测序数据的分析将根据每个实验室使用的流程而有很大差异。总的来说，建议至少使用两种调用器进行突变和CNA的调用，并且只报告由两种算法都调用的事件。对于易位，倾向于使用两种调用器，并报告至少一种调用器调用的任何事件，因为它们的灵敏度较低但特异性较高。

虽然识别事件的等位基因频率的cutoff值尚未标准化，但专家组建议采取保守方法以最小化识别假阳性的风险。在建议的深度下，突变的安全变异等位基因频率截断值可设定在5%左右。对于CNA，当前算法本身的识别就表明至少有20%的克隆性，因此，所有识别的事件都应报告。对于IGH易位，映射到14q32位点的读段质量可能较低，但映射到伙伴染色体的配对读段必须具有更高质量。在这种情况下，如果断点靠近已知的癌基因，即使只有10个支持性读段也应接受为真阳性结果。

支持易位判读的读段cutoff值更明确的标准，将由各实验室通过内部验证工作来确定，这些工作需比对NGS数据与FISH结果。一个潜在的注意事项是，NGS有可能识别出FISH未能识别的小片段间质缺失。对于染色体1p32区域的缺失，这种情况可能尤为常见。

最后，重要的是要注意，迄今为止没有关于MM NGS panel的论文彻底解决结果报告的策略。根据国际指南，报告应尽可能全面和具有解释性，包括患者和样本特征信息、样本特异性检测性能、观察到的改变，以及用于诊断、预后和治疗选择的基因组数据解读部分。实际上，NGS panel的输出，特别是在PC增生性疾病的背景下，需要进一步讨论以精确定义应报告哪些信息以及应如何呈现。

未来方法

上述证据和建议描绘了常规实践中NGS诊断的一种方法。然而公平地说，这种方法目前仅在少数中心使用，而大多数中心仍依赖FISH。毫无疑问，随着时间的推移，实验室将对NGS方法与FISH相比的准确性获得信心，并且随着时间的推移，前者也将成为标准。认证NGS性能的验证要求可能因国家而异，因此无法提供与FISH相比的灵敏度和特异性的硬性cutoff值。然而，在所有已发表的研究中，NGS的表现与FISH相当甚至更好，因此对其价值几乎没有疑问。

NGS还提供了一种更具“面向未来”的诊断方法，因为它比FISH具有更高的可扩展性。在这方面，已经可以勾勒出未来MM中NGS诊断发展的主题（图2）。

第一点当然涉及在MM基因分型方法中理想追求的覆盖广度。实际上，靶向panel的优点是每个患者所需的测序碱基更少，从而也降低了下游分析的复杂性和成本。另一方面，探针的生产成本高昂且需要时间，富集步骤增加了覆盖均匀性的变异性。对MM基因组驱动因素认识的进步最终将突出新的预后和预测标志物，这些将需要定期更新NGS诊断panel。随着需要非常少起始材料的更高效方案、更高通量的测序仪以及降低的存储计算成本的到来，一个更实用的策略可能是对每位患者进行WGS，这也需要匹配的种系样本、更高通量的测序机和更强大的IT基础设施。然而，NGS将具有简化分析前步骤（即不需要靶标捕获）的优势，并为未来的预后和预测评分提供更具“面向未来”的方法。例如，大多数靶向panel不适合识别MYC、IGL或IGK易位，也不适合识别突变特征。这些事件目前具有预后性，尽管在当前模型中还未被捕获。而NGS将轻松提供这些额外信息及更多信息。例如，一些药物靶点的序列（如CD38）在对达雷妥尤单抗耐药的病例中可能发生突变，或者B细胞受体位点的高变区，后者以后可用于微小残留病检测。最后，虽然长期以来高倍体性被认为是染色体范围的事件，但最近的NGS研究强调了如何仅获得高倍体染色体的一部分，而这是FISH无法看到的事件。对于NGS的广泛使用是否有助于完善主要MM细胞遗传学类别的定义，目前还有争议。

另一种未来的方法将是从外周血中进行肿瘤DNA的基因组分析，例如可以通过分析诊断时少量的cPC来实现——由于分离cPC的障碍以及使用仅提供的少量基因组DNA，该方法在技术上仍然具有挑战性，但当应用尖端基因组技术时，其与BM分析一样具有信息性，甚至可能更多。或者，游离DNA（cfDNA）也可用作肿瘤DNA的来源。许多作者已经尝试了这种方法，但结果各不相同。尽管有前景并且对患者来说肯定更舒适，但在这些方法可以被考虑用于常规临床级诊断之前，需要更多的验证和更高的灵敏度。得益于允许以高深度和准确性对全基因组进行测序的技术进步，肿瘤cfDNA的分析正在获得发展势头，并有可能在未来在癌症诊断中发挥更明确的作用。

NGS方法在MM预后判断中的一个关键问题在于测序分析的标准化和突变报告的协调。虽然当前的建议仅旨在提供共识，但多个实践问题仍未得到解答。很可能大多数实验室采用略有不同的测序试剂和分析工具来在MM中执行NGS。然而，这些工具正变得越来越准确和易于使用，并且在用于检测突变（例如，其中包括Mutect2、Strelka2、Varscan2和Freebayes）、CNA（例如，CNVkit、Copywriter）和IGH易位（例如，Manta、Delly）的工具选择上存在广泛共识。在这种情况下，建议采用外部质量评估服务，以认证跨实验室的最低标准；例如，通过标准化样本的测序练习。EMN提供了欧洲最大的MM临床网络，其结构还包括能够在EMN临床试验内执行临床级NGS的中心实验室。当然，利用这一有利地位，EMN可以促进其网络内在临床试验之外的常规临床实践中，临床级MM NGS诊断的均匀发展。

另一个悬而未决的问题在于，基于RNA测序的预后判断是否会在MM的常规临床实践中占有一席之地。实际上，基于RNA的NDMM分类在NGS出现之前就已经提出，在随后的几年中，已经提出了几种基于RNA的NDMM风险评分，但由于缺乏标准化和一致性，以及使用RNA而非DNA工作的麻烦，它们的广泛使用从未在临床试验之外获得关注。然而，基于RNA的预后判断相对于基于DNA的测序具有明确的附加价值，并且正在类似乳腺癌和急性淋巴细胞白血病的环境中常规使用。优势范围很多，从识别在DNA水平未被捕获的风险生物标志物，到基于表达识别IGH、IGL或IGK易位的潜力，再到基于表达识别预测标志物（例如BCL2表达增加与对维奈克拉和其他BCL2抑制剂的敏感性相关）。实际上，通过集中基因表达平台进行风险评估的可行性最近已在一个成功的HR骨髓瘤临床试验中得到展示。

最后，另一个问题将涉及NGS诊断在更广泛的PC增生性疾病领域中的应用。虽然可以理解NDMM一直是研究最集中的主题，但复发和/或难治性疾病也可以受益于高级诊断。在不久的将来，BCMA或GPRC5D突变或缺失可能成为对CAR-T细胞或双特异性抗体反应的预测标志物，需要在复发时重复检测以允许治疗个性化。更一般地说，HR特征在复发时富集，并且预后可能基于它们的存在而改变，即使在RRMM中也是如此。此外，有足够的证据表明，NGS可以应用于冒烟型骨髓瘤（SMM）以预测进展风险。实际上，SMM的预后判断使用了不同的策略，包括生化、放射学、病理学、免疫表型和FISH方法，存在显著的不一致性。在治疗HR SMM作为延迟进展和延长生存期的策略存在争议的时代，采用NGS诊断可能会就更精细的进展风险分层达成共识，从而有益于明确识别可能适合治疗的SMM患者。实际上，对于SMM，克隆性PC的比例较低，并且CD138⁺样本可能被大量正常PC污染，因此NGS很可能比FISH表现更好。重要的是，应注意在SMM中，用于预测进展的基因组预后因素与NDMM中的有本质不同。例如，MYC与IGH、IGK、IGL的经典易位和非经典易位（例如到FAM46C位点），KRAS、NRAS和DNA损伤反应基因的突变都与SMM的预后有关。

与之类似，初步证据表明，基因组病变也可用于改善原发性浆细胞白血病的预后判断，而关于AL型淀粉样变性的证据仍不成熟。然而，未来NGS诊断很可能也会应用于这些疾病。

总体而言，高级诊断的更广泛目标是通过改进治疗方法使患者受益。在骨髓瘤中，过去十年的治疗进展是惊人的，并且首次成功进行了临床试验，使用包括抗CD38抗体在内的强化四药联合方案一线治疗HR疾病。此外确实有证据表明，在管理HR MM时移植策略应有所不同，尤其是在强度较低的诱导方案背景下。更重要的是，对于HR患者，维持治疗不应停止，甚至应加强。在不久的将来，得益于风险定义的新共识，将会有更多针对高危多发性骨髓瘤一线治疗的研究展开。这将催生基于诊断时风险分层的个体化治疗新方案，从而必然推动先进诊断技术的应用——而二代测序技术的推广将使这一进程获益。

参考文献

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