体细胞突变是造成细胞癌变的主要原因，并可能导致衰老和其他疾病。随着年龄的增长，许多组织细胞会慢慢积累体细胞突变，但大部分突变仅存在于少量细胞甚至是单个细胞中。在少量克隆中检测突变的挑战，使我们对体细胞突变的理解仍然有限。

2021年，英国Sanger研究所团队在Nature发表了一项新双端DNA测序技术NanoSeq，利用限制性内切酶产生无需末端修复的平末端，并在缺口末端引入双脱氧核苷酸来终止缺口延伸，防止错误传递。NanoSeq在单个DNA分子中错误率低于每10亿碱基对5个错误，远低于体细胞变异频率，大幅提升了测序精确度，使研究不同因素对健康细胞的影响变得更容易。但该技术并不适于驱动突变的发现，因为限制性内切酶只覆盖部分人类基因组。

近日，Sanger研究所团队在Nature报道了改进的NanoSeq技术，在保持超低错误率的同时，可兼容全基因组测序、全外显子组测序和靶向测序。改进的NanoSeq可对多克隆样本进行单分子灵敏度的深度测序，同时分析大量克隆的基因信息，从而准确检测任何组织中的突变率、突变特征以及驱动突变。研究团队利用NanoSeq首次绘制了人类口腔上皮细胞的“体细胞突变图谱”，揭示了46个癌症相关基因在正常组织中就已发生突变，并发现每位老年人平均携带超过6.2万个驱动突变。这一精确的单分子测序技术为研究早期癌变、癌症预防以及体细胞突变在衰老和疾病中的作用提供了有力的工具。

主要研究内容

为保持超低错误率的同时实现全基因组的表达，研究团队选择了2种DNA片段化方法：(1)超声处理，然后进行外切酶钝化；(2)在优化的缓冲液中进行酶裂解，以消除链间的错误传递。经过广泛优化，改进的NanoSeq以与原始版本相似的效率和错误率实现了全基因组覆盖。该技术使用的片段化方法可用于除双端测序之外的其他纠错测序方法，如CODEC、SMM-seq或hidef -seq，能够在保证全基因组覆盖率的同时，有效降低测序错误率。

研究团队将上述新方案与靶向捕获相结合，获得的靶向NanoSeq可以准确地量化任何组织中的体细胞突变率、突变特征和驱动突变，为同时分析数百个克隆的驱动突变提供了一种有效方法。

研究团队收集了来自TwinsUK的1042名志愿者（包括332对双胞胎）的口腔拭子，使用包含239个基因的panel（覆盖约0.9 Mb）进行了靶向NanoSeq，测序深度平均为665dx，所有样本的总覆盖度达到693,208dx（图1a,b）。此外，研究还对来自上述队列中双胞胎个体的371份血液样本应用了NanoSeq技术，总覆盖度达到了250,947dx。血液数据分析表明，靶向NanoSeq检测了已知的突变率、突变特征和驱动突变，突变率和三核苷酸谱与之前的造血干细胞群体全基因组测序一致（图1c），并发现了14个受正选择的基因（图1d），这些基因均为已知的克隆性造血相关关键基因。在所有检测到的突变中，有95%的突变仅由一个测序分子检测到；99%突变的变异频率（VAF）低于1%；此外，90%突变的变异频率低于0.1%。总之，以上结果证实了靶向NanoSeq在高度多克隆样本中检测突变率、突变类型和自然选择的能力。

图1.靶向NanoSeq技术与验证。

数据显示，该分析共检测到了341,682个体细胞突变，其中包括160,708个编码单核苷酸变异（SNV）以及29,333个编码Indel。研究显示，口腔上皮的突变随着年龄的增长呈线性积累，突变率为18.0个SNV每细胞/每年，2.0个Indel每细胞/每年（图2a，b）。由于这些比率是从突变率较低的基因区域推断出来的，因此研究人员对16个样本应用酶切NanoSeq，发现口腔上皮的全基因组突变率大约为23个SNV每细胞/每年。

该部分数据揭示了一个前所未有的丰富的突变选择图谱。研究发现46个基因为正选择，其中31个基因此前在皮肤或食道研究中未见报道，包括头颈部鳞状细胞癌的几个相关驱动基因。这些正选择基因的克隆中有超过90,000个非同义突变，其中约62,000个被估计为驱动突变（图2c-f）。口腔上皮中驱动突变的密度明显低于食管（NOTCH1或TP53低3-4倍），正常食管中的一些强驱动突变在口腔上皮中似乎是中性或弱选择的（KMT2D、NFE2L2和PIK3CA）。

为确保239基因panel没有遗漏主要驱动突变，研究团队对12个样本进行了外显子组NanoSeq，总覆盖率为1,024dx。分析重新鉴定了NOTCH1、TP53、PPM1D、RAC1和ZFP36L2，表明该panel包括口腔上皮中最常见的驱动突变。

数据显示，口腔上皮由大量小克隆组成，在老年人中，10-20%的口腔细胞携带驱动突变。在65-85岁的个体中，携带驱动突变的细胞平均比例约为NOTCH1 10%，TP53 3%，NOTCH2、CHEK2和ATM为1%（图2e）。

NanoSeq技术也为基因突变的负选择分析提供了前所未有的能力。研究团队发现在239基因panel中有9个基因处于显著负选择（图2g）。其中，PIK3CA、SF3B1和TERT对截短突变表现为负选择，对激活热点突变表现为正选择，说明这些基因既是野生型口腔细胞必需基因，也是获得激活突变的驱动因子。

图2.1042名个体口腔上皮驱动突变分析。

研究团队利用NanoSeq技术绘制了TP53、NOTCH1、PPM1D等主要驱动基因的高分辨率选择图谱（图3a-c）。其中，TP53编码突变的分布反映了在COSMIC数据库中观察到的数千种癌症。在TP53中发现的突变几乎与在44,000个癌症外显子组和基因组中发现的突变一样多，对于其他几个驱动基因，这里报告的突变数量远远超过了以前在癌症研究中观察到的所有突变。TP53对DNA结合域的错义突变和跨基因的截短突变表现出很强的选择性。

图3.口腔上皮的主要驱动基因选择图谱。

靶向NanoSeq还提供了与衰老、吸烟和饮酒相关的个体间突变率和特征的信息，发现了两个主要的突变特征：SBS5、SBS1特征以及SBS16特征。其中SBS16特征的个体差异显著，大多数个体的突变数量很低，但在一些酗酒者中，每个细胞的突变数量超过1000个，且多位于非编码区。吸烟与NOTCH1基因的更多突变和突变克隆密切相关。研究显示，个体每增长1岁，其口腔上皮产生的突变数量与大约2.8包烟年或19.1饮酒年所产生的突变数量相当。

结 语

该研究报道的改进NanoSeq技术可以在单个DNA分子上实现准确的体细胞突变检测，并与全基因组、全外显子组和深度靶向测序兼容。这种方法大大简化了任何组织中体细胞突变率、突变特征和驱动突变的研究。靶向NanoSeq在口腔上皮中揭示了正常实体组织中前所未有的基因选择特征，证明了高度多克隆组织的深度单分子测序可以产生高分辨率的基因选择图谱。

研究团队计划将改进的NanoSeq技术应用于多个研究项目中，评估健康人群的癌症风险，探索体细胞突变在非癌疾病中的作用程度，比如心血管疾病、神经退行性疾病、免疫系统疾病以及衰老过程。

原文信息：

Lawson, A.R.J., Abascal, F., Nicola, P.A. et al. Somatic mutation and selection at population scale. Nature (2025). https://doi.org/10.1038/s41586-025-09584-w

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