CAR-T疗法（嵌合抗原受体T细胞疗法）通过基因工程技术改造患者自身的T细胞，使其表达特定的嵌合抗原受体（CAR），从而能够更精准地识别和攻击癌细胞。CAR-T疗法已在血液系统肿瘤中取得成功，但在实体瘤中效果有限，主要受肿瘤免疫抑制、抗原异质性和细胞迁移受限等因素影响。为了增强CAR-T细胞的抗肿瘤能力，研究者尝试工程细胞表达促炎细胞因子（如IL-12），但系统性表达带来严重毒性。现有策略多依赖合成启动子（如NFAT）调控，但控制不够精细，存在泄漏表达和毒性风险。

近日，澳大利亚昆士兰大学的 Amanda X. Y. Chen 等团队联合在 Nature 发表了题为 Rewiring endogenous genes in CAR T cells for tumour-restricted payload delivery 的文章，提出了一种基于CRISPR 基因编辑技术的创新策略，以增强CAR-T细胞抗肿瘤效果并降低毒性。研究通过筛选肿瘤微环境中特异性表达的内源性基因启动子（如NR4A2和RGS16），将抗肿瘤因子（如IL-12和IL-2）定向表达在肿瘤部位。实验结果显示，这种策略在动物模型中显著提高了抗肿瘤效果，且安全性优于传统的合成启动子系统。该方法还成功应用于患者来源的T细胞，展现出良好的临床潜力。

CRISPR基因编辑：设计同源修复模板，将报告基因（如GFP）插入目标基因的启动子区域，利用CRISPR实现定点插入。

研究者选择了Pdcd1基因作为原型，因为该基因在T细胞激活时表达上调。通过设计同源修复模板，将GFP基因插入Pdcd1起始密码子下游，实现了在内源Pdcd1启动子控制下的转基因表达。实验结果显示，PD-1/GFP编辑的OT-I细胞在刺激后显著上调GFP表达，证明了该策略的成功。

随后，研究者将编辑后的OT-I细胞转移到携带表达卵白蛋白抗原的AT-3肿瘤小鼠体内，发现肿瘤内的PD-1/GFP表达明显高于脾脏，表明Pdcd1启动子驱动的转基因表达具有肿瘤局部特异性。此外，为评估HDR装甲T细胞的治疗潜力和安全性，研究者进一步改造OT-I细胞，使其分泌在全身给药时具有毒性的促炎细胞因子。然而，在评估PD-1/IL-12 OT-I细胞时，观察到全身毒性，因此，研究者试图寻找比Pdcd1更优的替代启动子。 

CRISPR敲入策略以构建具有肿瘤限制性转基因表达的装甲T细胞。

筛选肿瘤特异性基因启动子：通过RNA测序分析，筛选在肿瘤微环境中高表达的内源性基因（如NR4A2和RGS16）。

研究者通过对两种CAR-T细胞模型（小鼠抗hHer2和人抗Lewis Y）的肿瘤和脾脏中的CD8+ CAR-T细胞进行RNA测序，比较了肿瘤内与脾脏中基因表达的差异，发现许多基因在肿瘤中的表达显著上调。

在这些基因中，研究者选取了27个差异表达幅度较大的基因进行进一步分析，其中有12个基因在肿瘤与脾脏的表达差异超过了Pdcd1基因（即PD-1的编码基因），这表明它们可能更适合作为肿瘤局部特异性表达的启动子。

随后，研究团队利用CRISPR技术对这27个基因在人体抗LeY CAR-T细胞中进行敲除，评估基因敲除对细胞因子产生、细胞毒性和增殖能力的影响。通过这些功能性筛选，确定了NR4A2和RGS16基因作为后续CRISPR敲入转基因的靶点。

最佳靶基因的鉴定

体内模型验证：在小鼠肿瘤模型中，将编辑后的T细胞输注，检测转基因表达的肿瘤特异性和毒性。

NR4A2启动子驱动的IL-12表达不仅增强了CAR-T细胞的抗肿瘤活性，还显著降低了外周毒性，展现出良好的治疗潜力和安全性。利用NR4A2启动子驱动的转基因（如GFP）在体外刺激后表现出显著且严格受控的表达，优于PD-1启动子驱动的表达。在体内，肿瘤部位的转基因表达明显高于脾脏，脾脏中表达率低于1%，显示出极强的肿瘤局部特异性。将NR4A2/IL-12 OT-I细胞移植到携带AT-3-ova肿瘤的小鼠体内，显著抑制肿瘤生长并延长小鼠生存期，同时小鼠体重保持稳定，表明该策略具有良好的耐受性和安全性。研究还比较了NR4A2内源启动子与合成NFAT启动子驱动的表达，发现NR4A2启动子在肿瘤特异性和表达调控方面表现更优，支持其作为更安全有效的转基因表达调控元件。

NR4A2/IL-12基因工程T细胞具有良好的耐受性，并能激发强大的抗肿瘤免疫反应。

细胞因子表达和功能检测：工程T细胞表达IL-12、IL-2等促炎因子，评估其抗肿瘤效果和安全性。

NR4A2/IL-12工程化T细胞不仅直接发挥抗肿瘤作用，还通过促进宿主内源性抗肿瘤免疫，尤其是通过表位扩散机制，增强了整体的治疗效果和免疫记忆形成。

NR4A2/IL-12基因工程T细胞表现出增强的促炎表型，并能有效促进宿主抗肿瘤免疫反应。

患者样本验证：利用公开单细胞RNA测序数据和患者T细胞，验证目标基因在肿瘤中的表达情况。

利用NR4A2启动子驱动的IL-12表达能够显著增强人源CAR-T细胞的抗肿瘤活性和功能，同时保持良好的安全性，并且该策略在患者来源的CAR-T细胞中具有临床应用潜力。CRISPR敲入方法能够克服CAR-T细胞向实体瘤迁移受限的问题，并且通过“一步法”同时将转基因插入NR4A2或RGS16基因位点及CAR插入TRAC位点，简化了临床生产流程。

CRISPR工程化人源CAR T细胞的治疗效果与临床应用前景。

综上所述，本研究成功开发了一种基于CRISPR敲入的创新策略，通过将治疗性基因精准整合到内源肿瘤限制性基因（如NR4A2和RGS16）位点，实现了CAR-T细胞在肿瘤微环境中的特异性转基因表达。这种方法不仅显著增强了CAR-T细胞对实体瘤的杀伤效果，还有效降低了因转基因在外周组织表达引发的毒性风险，提升了治疗的安全性和有效性。

尽管如此，研究也指出了当前技术面临的挑战，如CRISPR脱靶效应、多位点编辑可能导致的染色体异常风险，以及靶点基因在某些非肿瘤组织的表达可能带来的潜在毒性问题。未来工作需进一步优化靶点选择和编辑策略，以确保临床应用的安全性和稳定性。

Tags： Nature：基因编辑+免疫治疗双剑合璧：CAR-T疗法新升级