在过去十年中，神经病理学诊断经历了显著变革，将形态学特征与分子生物标志物相结合。分子时代已成功提升了神经病理学诊断的准确性；然而，相当数量的中枢神经系统（CNS）肿瘤诊断仍然具有挑战性，尤其是在儿童群体中。DNA甲基化分类已成为CNS肿瘤临床决策中一种强大的机器学习方法。本研究的目的是分享研究者在日常实践中使用DNA甲基化分类的经验，并通过临床病例进行说明。研究者采用了一种分类系统来评估组织分子诊断与DNA甲基化诊断之间的差异，特别关注成人 vs 儿童CNS肿瘤。

本研究观察到在“匹配病例”（≥0.84）中，40%的病例属于I类，47%属于II类，13%属于III类。换句话说，DNA甲基化分类在63%的成人病例和23%的儿科病例中证实了形态学诊断。诊断的细化在儿科人群中尤为明显（65% vs. 成人人群的21%，p=0.006）。此外，本研究还讨论了校准分数较低的病例。总之，本研究证实DNA甲基化分类为CNS肿瘤的诊断提供了重要的附加价值，尤其是在儿科病例中。

研究背景

在过去十年中，神经病理学诊断发生了巨大变化，将形态学特征与免疫化学（IHC）和分子生物标志物（包括IDH1/2突变、1p19q共缺失或H3F3A K27M突变）相结合。分子时代成功提高了神经病理学诊断的准确性；然而，大量中枢神经系统肿瘤的诊断仍然具有挑战性。

2021年，世界卫生组织（WHO）中枢神经系统肿瘤分类第五版引入了新的组织分子实体，导致超过150种组织学和/或分子学上不同的实体。这突显了中枢神经系统肿瘤类型和亚型的广泛多样性，以及这些肿瘤固有的复杂性和异质性，尤其是在儿科人群中。分子检测的整合，被WHO分类指定为某些肿瘤类型的“基本诊断标准”，给神经病理学诊断的日常实践带来了挑战。事实上，中枢神经系统肿瘤中已识别的分子变异数量不断增加，包括突变和致癌融合，这对分子生物学实验室的工作流程构成了重大挑战。

尽管如此，组织分子实体的定义至关重要，因为它减少了诊断的主观性，能够为患者提供更准确的预后和定制的治疗管理。

最近，DNA甲基化分类已成为临床决策和改善中枢神经系统肿瘤生物学理解的强大机器学习方法。DNA甲基化作为表观基因组的稳定组成部分，对细胞及其起源组织具有特异性。因此，它可用于建立谱系分类。此外，癌症甲基组的研究还反映了额外的体细胞变异，如IDH突变，其诱导DNA高甲基化，导致“胶质瘤CpG岛甲基化表型”（G-CIMP）。这些表观遗传特征已被证明可有效用于中枢神经系统肿瘤的亚分类，如室管膜瘤、中枢神经系统胚胎性肿瘤和脑膜瘤。

德国癌症研究中心（DKFZ）和海德堡大学开发了一种基于DNA甲基化的中枢神经系统肿瘤分类模型，通常称为“分类器”。当前版本（v12.8）包含超过174个不同的甲基化类（MCs）。除了DNA和RNA分子检测外，这个在线工具（www.molecularneuropathology.org）可以完善传统的形态学诊断，并且在某些情况下，通过引入新的组织分子实体来修订诊断。

本研究的目的是分享研究者在日常实践中使用DNA甲基化分类的经验，并通过临床病例进行说明。研究者还比较了该技术在成人和儿童中枢神经系统肿瘤队列中的诊断准确性。此外，研究者评估了其对患者管理的影响，并描述了通过DNA甲基化谱识别的潜在新组织分子实体。

研究方法

将原始甲基化数据（IDAT 文件）上传至在线可用的 DNA 甲基化分类器 v12.8。来自德国癌症研究中心（DKFZ）的这种基于随机森林的MC预测算法生成了一份报告，其中包括与相应校准评分（CS；取值范围从0到1）相关的甲基化肿瘤诊断的预测匹配。CS表示甲基化类（MC）预测的置信度指数。还生成了染色体拷贝数变异（CNV）图。如果CS至少为0.84，研究者认为该结果与参考MC“匹配”。CS在0.3 ~ 0.84之间，解释存在争议，需进一步分析，本文对此进行讨论。CS低于0.3则丢弃。

为评估DNA 甲基化分类的潜在诊断影响，研究者根据 Schepke 等人的建议进行分类：I 类：证实了诊断，甲基化分类与组织病理学诊断一致；II 类：证实并细化诊断，提供额外分子信息。这导致了精确的诊断，通常与临床影响低相关（例如，DNA甲基化提供了标准诊断无法获得的分子亚组数据）；III 类：与初始诊断不同，甲基化分类提出新的肿瘤类型，可能对临床有影响。CS 在 0.3-0.84 之间的病例被视为低置信度分类，CS<0.3 时为未分类。

研究结果

队列的临床病理与分子特征：

表1详细列出了本研究队列中观察到的临床和病理特征。共纳入70例患者（n=36成人，34儿童），其中47例样本来自初次切除标本，23例来自复发肿瘤。1例患者同时分析了初次手术和后续复发的样本甲基化谱。

表1

儿科人群（<18岁）和成人人群分别占70例患者的34例（49%）和36例（51%）。儿科队列的诊断中位年龄为4岁，成人队列为54岁。肿瘤定位方面，51%（36/70）为中线肿瘤，49%（34/70）位于大脑半球。

成人队列的组织分子病理诊断（n=36）： 

成人人群中大多数诊断为高级别（HG）肿瘤（n=25/36；69%）：

• 胶质母细胞瘤（n=15）：表现为假室管膜（n=2）、毛细胞型（n=3）、乳头状（n=1）、假肉瘤样（n=3）、巨细胞（n=2）、原始神经元成分（n=2，包括1例H3G34变异的弥漫性半球胶质瘤）和“青年多形性低级别神经上皮肿瘤（PLNTY）样”（n=1）特征。此外，1例IDH野生型胶质母细胞瘤因非典型分子谱（含ATRX K1045*突变、TP53 M133T突变、CDKN2A纯合缺失但无IDH突变）纳入研究。

• 其他HG胶质瘤（n=7）：包括疑似伴毛细胞特征的HG星形细胞瘤（HGAP，n=2）、间变性多形性黄色星形细胞瘤（PXA，n=3），以及1例虽携带TP53 S241F突变但无1p19q共缺失、具有“少突胶质细胞瘤样”特征的HG胶质瘤。此外，1例被诊断为BRAF T599dup突变毛细胞型星形细胞瘤（1级）的间变性进展。

• 低分化“蓝细胞”肿瘤（n=3）：包括1例多层菊形团胚胎性肿瘤（ETMR）、1例CNS胚胎性肿瘤NOS，以及1例中间分化的松果体实质肿瘤（PPTID）与松果体母细胞瘤鉴别病例。

低级别（LG）和中间型病例（n=11）包括1例毛细胞型星形细胞瘤、1例血管中心性胶质瘤、3例脊髓室管膜瘤、1例后颅窝（PF）室管膜瘤、2例非典型脑膜瘤和1例2级PXA。此外，2例被确定为神经胶质神经元肿瘤NOS：1例伴1p19q共缺失，另1例伴POLE A724V突变（生物学和临床意义未知），但无其他突变或致癌融合。

儿科队列的组织分子病理诊断（n=34）： 

儿科人群中，34例中有23例（68%）为HG肿瘤，主要为“低分化”肿瘤、胚胎性肿瘤（n=18；78%）：髓母细胞瘤（n=11）和其他CNS胚胎性肿瘤（n=7：4例非典型畸胎样/横纹肌样瘤（ATRT）、1例ETMR、1例CNS胚胎性肿瘤NOS和1例神经母细胞瘤）。其他病例包括胶质肿瘤（n=5；22%），如3例弥漫性HG胶质瘤、1例H3K27变异的弥漫性中线胶质瘤（DMG）和1例PFA亚型PF室管膜瘤。

检测的儿科LG肿瘤（n=11；32%）：

• 4例表现为胶质神经元模式，包括2例伴罕见致癌融合（BRAF-FAM131B和ROS1-GOPC）和1例伴非典型定位（丘脑）。最后1例诊断为节细胞胶质瘤（BRAF V600E突变），局部区域KI-67增殖指数高（与1p19q杂合性缺失（LOH）特异性相关）。

• 3例诊断为LG儿科型弥漫性胶质瘤：1例疑似PLNTY（伴FGFR2-CTNNA3融合），1例与胚胎发育不良性神经上皮肿瘤（DNET）鉴别诊断，未检测到DNA/RNA分子变异，1例位于丘脑的LG儿科型弥漫性胶质瘤通过DNA和RNA测序未发现分子变异。 

• 2例诊断为脊髓毛细胞型星形细胞瘤（伴KIAA1549-BRAF融合）和脑干毛细胞型星形细胞瘤。后者表现为毛细胞型模式伴BRAF V600E突变，需鉴别毛细胞型星形细胞瘤和节细胞胶质瘤。

基于DNA甲基化分类的校准分数： 

 

为评估形态学与DNA甲基化诊断的差异，研究者整合了Capper等人推荐的DNA甲基化分类阈值（CS=0.84）。需注意的是，脑分类器v12.8推荐的阈值为0.9，因此表2也纳入了CS≥0.9的病例用于对比。

表2

DKFZ分类器将70例原发肿瘤中的41例（59%）分配至特定DNA甲基化类，CS≥0.9。成人中，36例中有16例（44%）的最高校准分数>0.9，17例（47%）的最高分数为0.3-0.9，3例（8%）“未分类”。儿科人群中，34例中有25例（74%）的最高校准分数>0.9，4例（12%）的最高分数为0.3-0.9，5例（15%）未分类。

当应用CS≥0.84时，70例原发肿瘤中有45例（64%）被分配至特定DNA甲基化类。成人中“匹配病例”（≥0.84）的比例为53%（19/36），39%（14/36）的CS为0.3-<0.84，8%（3/36）未分类（CS＜0.3）（表2）。

儿科人群中“匹配病例”（≥0.84）的比例为76%（34例中26例），9%（3/34）的CS为0.3-<0.84，15%（5/34）未分类（CS＜0.3）（表2）。

基于DNA甲基化分类的诊断影响：   

表2描述了分类病例（CS≥0.84）的比例，以及诊断被确认、细化或改变的情况。高分病例（CS≥0.84）的组织分子与DNA甲基化诊断差异见图1。

图1

确认组织分子诊断（I类）： 

成人人群中，“DKFZ分类器”分数与组织病理数据整合后，12例（I类；12/36；33%）确认初始诊断，占“匹配病例”的63%（12/19）。儿科人群中，6例（I类；6/34；8%）确认初始诊断，占“匹配病例”的23%（6/26）。

细化组织分子诊断（II类）： 

成人中，DNA甲基化分析使4例（II类；4/36；11%）诊断得以细化，占“匹配病例”的21%：

• 1例胶质神经元肿瘤NOS分类为“弥漫性软脑膜胶质神经元肿瘤（DLGNT）I亚型”；

• 1例IDH野生型弥漫性HG胶质瘤（疑似HGAP）分类为“IDH野生型胶质母细胞瘤，间充质型”；

• 1例血管中心性胶质瘤分类为“MYB/MYBL1变异型血管中心性胶质瘤”；

• 1例伴PXA特征的IDH野生型胶质母细胞瘤分类为“IDH野生型胶质母细胞瘤，RTK1型”。

儿科人群中，17例（II类；17/34；50%）诊断得以细化，占“匹配病例”的65%，主要涉及CNS胚胎性肿瘤，尤其是髓母细胞瘤（n=10；分为3、4和SHH组）和ATRT（n=4；分为MYC和SHH亚型）（图1C）。 其他细化诊断包括：

• 1例胶质神经元肿瘤NOS分类为“DNET”；

• 1例弥漫性HG胶质瘤分类为“儿科型弥漫性HG胶质瘤，RTK2亚型”；

• 1例疑似DNET的LG儿科型弥漫性胶质瘤分类为“DNET”。

该诊断类别中未观察到WHO分级改变。

诊断修改，包括新型DNA甲基化实体（III类）： 

成人中3例（3/36；8%）的DNA甲基化分析与初始诊断不同（均涉及WHO分级改变）：

• 病例1：初始诊断为间变性PXA，甲基化分类为“IDH野生型胶质母细胞瘤（RTK2亚型；cs=0.57）”。未发现突变，但CNV谱显示7号染色体获得和10号染色体缺失。重新评估后诊断为IDH野生型胶质母细胞瘤，WHO分级从3级升至4级。患者术后1个月死亡，无随访数据。

• 病例2（图2A-C）：初始诊断为伴间变性特征的毛细胞型星形细胞瘤，甲基化分类为“幕下毛细胞型星形细胞瘤”。该病例存在BRAF T599dup突变。这个肿瘤是先前诊断的毛细胞型星形细胞瘤（甲基化分类“未分类”）的复发灶（图2A）。有趣的是，原发肿瘤无变性特征但携带相同BRAF T599dup突变，复发灶的CNV谱不同，并且显示原发肿瘤不存在的染色体获得（图2B,C）。此例中，DNA甲基化分类将WHO分级从3级降至1级。二次切除后未行辅助治疗，肿瘤稳定无复发。

图2

• 病例3（图2D,E）：初始诊断为2级脊髓室管膜瘤（图2D），甲基化分类重新定为“脊髓室管膜下瘤B亚型（cs=0.76，潜在新型DNA甲基化实体）”。该病例存在TERT启动子突变，CNV谱显示6、8号染色体缺失及1号染色体部分缺失（图2E），WHO分级从2级降至1级。

所有病例均伴随WHO分级改变，其中1例（病例2）发生重大分级改变（1级vs 3级）。

儿科人群中，3例（3/34；9%）的DNA甲基化分析与形态学诊断不同，占“匹配病例”的12%：

• 病例1：初始诊断为（颞叶）节细胞胶质瘤伴高KI-67增殖指数，分类为“半球毛细胞型星形细胞瘤”。初始检测到BRAF V600E突变和1p19q LOH（仅限于高增殖区域）（图3A,B）； 

图3

• 病例2：初始诊断为（丘脑-中脑）血管中心性胶质瘤，分类为“MYB或MYBL1变异型弥漫性星形细胞瘤B亚型（幕下，潜在新型DNA甲基化实体）”，该病例存在BRAF I582T突变； 

• 病例3：初始诊断为（颞叶）胶质神经元肿瘤NOS，分类为“半球毛细胞型星形细胞瘤”。RNA测序显示BRAF-FAM131B融合（图3C,D）。

儿科人群中DNA甲基化分类后未观察到WHO分级改变。

低CS（0.3至<0.84）分类病例描述： 

成人中14例（14/36；39%）CS较低，视为“非诊断性”（表2）。尽管如此，8例（8/14；57%）的DNA甲基化诊断与形态学诊断一致（I类）。

3例（3/14；21%）诊断被细化，包括潜在新型实体（II类），其中1例胶质神经元肿瘤NOS分类为“弥漫性胶质神经元肿瘤A亚型（潜在新型DNA甲基化实体）”。

3例DNA甲基化诊断改变初始诊断（III类），包括：

• 病例1：初始诊断为ETMR，甲基化分类为“伴MN1:CXXC5融合的HG神经上皮肿瘤（潜在新型DNA甲基化实体，cs=0.76）”，FISH分析进一步证实MN1融合； 

• 病例2：初始诊断为PPTID，分类为“儿科型弥漫性HG胶质瘤RTK1亚型A亚类（新型，cs=0.82）”，该病例存在TP53 c.742C>T突变； 

• 病例3：诊断为IDH野生型胶质母细胞瘤，分类为“炎症微环境（cs=0.36）”，可能原因是样本中观察到高坏死区域。

儿科人群中3例（3/34；9%）CS较低，其中1例诊断确认（I类），1例确认并细化（II类），1例诊断不一致（1例伴FGFR2-CTNNA3融合的PLNTY分类为“节细胞胶质瘤”，CS=0.78，III类）。

未分类病例（cs<0.3）： 

成人3例（3/36；8%）和儿科5例（5/34；15%）得分最低，这些cs<0.3的病例无特定特征（如样本收集时间（5例收集于2023年前）、肿瘤定位（中线n=4，非中线n=4）或肿瘤类型/亚型）。

具体而言，多数“未分类”病例为HG肿瘤（n=6）：

• 成人人群中，形态学诊断为IDH野生型HG弥漫性胶质瘤（疑似HGAP，n=2）和伴毛细胞特征的IDH野生型胶质母细胞瘤（n=1），DNA和RNA测序至少发现1个突变：TERT启动子突变2例，PTPN11、EGFR、NF1、PTEN和TP53基因突变； 

• 儿科人群中，形态学诊断为神经母细胞瘤（n=1）、CNS胚胎性肿瘤NOS（n=1）和儿科型弥漫性HG胶质瘤（n=1），其中仅HG儿科型弥漫性胶质瘤分子检测发现突变（ACVR1和PTEN基因突变）。

其余“未分类”病例（n=2）均为儿科病例，1例神经胶质神经元肿瘤NOS和1例LG儿科型弥漫性胶质瘤。DNA和RNA测序未发现分子变异（1例未行分子检测）。

CS解读中整合肿瘤类型与分子谱：   

肿瘤类型与CS：

成人中，结果异质性大。所有室管膜肿瘤（n=4）均为高CS（≥0.84）；弥漫性HG胶质瘤（包括成人和儿科型，n=22）中仅45% CS≥0.84；LG胶质瘤/神经胶质神经元肿瘤（LG/LGGNT，n=5）中3例（60%）明确诊断为CS高。

儿科人群中，最可靠的分类肿瘤为髓母细胞瘤和ATRT，均CS≥0.84；LG/LGGNT（n=11）中7例（64%）CS高；HG胶质瘤（n=4）中50% CS≥0.84；“其他CNS胚胎性肿瘤”（n=3）中仅1例（ETMR）明确归类为CS高。

分子谱与DNA甲基化分类：

成人中，TERT启动子突变肿瘤（n=13/36，包括单独TERT突变或合并其他突变）中6例（46%）CS≥0.84，除1例诊断为脊髓2级室管膜瘤并分类为“脊髓室管膜下瘤B亚型”外，其余均分类为“IDH野生型胶质母细胞瘤”；5例（38%）TERT突变肿瘤CS较低（0.38-0.75），也均归为“IDH野生型胶质母细胞瘤”MC；2例（15%）未分类（CS < 0.3，1例伴毛细胞特征的胶质母细胞瘤，1例疑似HGAP的胶质母细胞瘤）。

无分子变异成人病例（n=7）中，4例（57%）CS≥0.84，获得最终诊断。

儿科人群中，MAPK变异胶质瘤（包括BRAF突变/融合和FGFR融合，n=7，21%）中5例（71%）CS≥0.84，包括5例“毛细胞型星形细胞瘤”、1例“节细胞胶质瘤”和1例“MYB或MYBL1突变型弥漫性星形细胞瘤B亚型”。

仅2例儿科病例（2/34，6%）携带TERT启动子突变，分别分类为“SHH亚型髓母细胞瘤”和“儿科型弥漫性HG胶质瘤RTK2亚型”，均CS≥0.84。

无分子变异儿科病例（n=8）中6例（75%）通过DNA甲基化分类CS≥0.84。

由DNA甲基化分类提出的新型儿科实体： 

病例1：

2002年，一名患有右侧颞叶肿瘤的3岁男孩被诊断为2级少突胶质细胞瘤（图4A）。当时未发现分子变异。2006年、2007年和2016年出现局部复发，随后考虑诊断为非特异性型胚胎发育不良性神经上皮肿瘤（DNET，KI-67增殖指数8%）。2021年，肿瘤扩散至对侧半球，进行了第五次肿瘤切除，诊断为伴有KIAA1549-BRAF融合的毛细胞型星形细胞瘤（图4B）。2024年，患者接受了骶骨（S2）肿瘤结节的手术切除。组织病理学分析显示，肿瘤由形态单一的圆形蓝染细胞增殖构成，染色质细腻，并伴有大量多核肿瘤细胞。此外可见密集的血管网络，具有假室管膜（假菊形团）特征，未观察到间变特征（图4C）。肿瘤细胞OLIG2和突触素弥漫性阳性，ATRX表达缺失，Ki-67增殖指数较低。研究者提出诊断为“未分类神经胶质神经元肿瘤，NOS”。分子检测显示1号染色体长臂LOH，无其他突变或致癌融合。分类器将该肿瘤归为“MC胶质神经元肿瘤，亚型A”，CNV图谱证实存在1q扩增、KIAA1549-BRAF融合及13q缺失（图4G）。

图4

病例2：

患者女，10岁，1996年因发作性头痛1个月，近期出现行走障碍伴右侧轻偏瘫就诊。眼科检查显示视乳头水肿。MRI显示左侧额叶有一巨大、边界清晰的肿瘤，直径约10-12 cm，行近全切除（98%）。显微镜下观察可见肿瘤边界清晰、细胞丰富，以假菊形团和多层菊形团为主（图4D）。肿瘤细胞小而嗜碱性，胞质少，染色质致密，间质为胶原性。未见坏死，但有高有丝分裂计数（图4E）。当时根据形态学诊断为室管膜母细胞瘤（1993年WHO分类），并给予辅助化疗。22年后，随访MRI显示左侧额部镰旁巨大病变伴瘤周水肿，开颅部位对应左侧半球硬膜下积液。此时，切除的肿瘤标本显示细胞增多、坏死，伴持续存在的假菊形团和多层结构（图4F）。DNA测序显示TP53 R283C和TP73 T45M突变。鉴于诊断存在不确定性，进行了DNA甲基化检测。DNA甲基化分析将其归为“伴有MN1-CXXC5融合的HGNET”MC。CNV图谱显示多处染色体部分缺失（图4H），荧光原位杂交（FISH）分析检测到MN1基因融合，进一步支持该结果（图4I）。

讨 论

基于DNA甲基化谱的海德堡脑肿瘤分类器已被证明是一种强大的工具，即使对于具有挑战性的CNS肿瘤也是如此。本研究评估并比较了DNA甲基化谱分析在70例成年和儿科中枢神经系统肿瘤患者队列中的准确性，还强调了DNA甲基化分类在描述潜在新型组织分子实体方面的关键重要性。

在本研究中，64%的病例成功分类（置信分数CS至少为0.84）。这些结果与既往研究一致，此前研究报告的分类率范围为49%-88%。此外，Karimi等人报道，使用该工具检测的病例中，84%的组织病理学诊断发生了具有临床意义的改变，其中15%的病例影响了患者的临床决策。这一具体方面将在下文进一步讨论。

 

除了既往研究，研究者还比较了DNA甲基化分类在成人和儿科人群中的准确性。有趣的是，研究者使用DNA甲基化谱分析了几乎相同数量的成人和儿科中枢神经系统肿瘤病例。对DNA甲基化分类准确性的比较显示，在大多数成人病例中（63%的匹配病例），组织分子诊断与基于甲基化的诊断一致。另一方面，有21%的匹配成人病例通过DNA甲基化分类得到了细化。

与成人病例相反，儿科病例的组织分子诊断不仅得到了“分类器”的确认，而且在大多数病例中（65%的匹配病例）得到了细化。DNA甲基化谱分析在肿瘤亚型分型中尤其有效，特别是对于髓母细胞瘤和ATRTs，分类器为其提供了分子亚群。这种分子分层尤为重要，因为它直接影响这些患者的预后和治疗策略。关于ATRTs，三种DNA甲基化亚型为ATRT-SHH、ATRT-TYR和ATRT-MYC。ATRT-SHH见于幼儿，生存率较高，常涉及SMARCB1点突变。ATRT-SHH似乎对NOTCH抑制剂的反应存在异质性，其中一部分显示出高敏感性。相比之下，ATRT-TYR见于婴儿，其特征是22号染色体长片段异常，而ATRT-MYC则存在SMARCB1纯合灶性缺失，似乎对多靶点酪氨酸激酶抑制剂高度敏感。非ATRT-TYR谱是独立的负预后标志物。

DNA甲基化分类还提供了进一步的细化，例如将弥漫性高分级儿科型胶质瘤亚分层为RTK1（A、B、C亚类）和RTK2（A、B亚类）亚型。RTK1和RTK2之间的差异具有临床意义，因为RTK1亚型与遗传性错配修复缺陷综合征（CMMRD）/林奇综合征相关，这表明当发现该甲基化分类时，应怀疑存在潜在的综合征。

与既往报道儿科病例中12.9%至25%的诊断得到细化的研究相比，本研究显示细化诊断的比例特别高，这是由于本队列中富含胚胎性中枢神经系统肿瘤，而DNA甲基化在其诊断中起着关键作用。

 

在本研究中，DNA甲基化分类导致8%的成人病例（16%的匹配病例）和9%的儿科病例（12%的匹配病例）的初始诊断发生了修改。这些发现与既往文献一致，此前报道的诊断修改率在6%-27%。在本研究中，所有诊断改变均涉及胶质肿瘤。

当分析诊断变更是否会对临床管理产生影响时，研究者评估发现：在成人病例中，DNA甲基化谱分析对1例病例的WHO分级产生了显著影响（1级vs.3级）。然而，所有通过DNA甲基化分类导致的诊断修改均引起了成人人群的分级变更。在既往一项大型研究中，22.5%的病例WHO分级被下调，48.9%的新诊断病例分级被上调。这些发现与Capper等人的队列研究结果相似。在本研究中，预计诊断修改的潜在临床影响将在2例病例中体现（占匹配病例的11%）。事实上，WHO分级上调可能影响临床管理和治疗策略，因为3级与4级胶质瘤（如间变性多形性黄色星形细胞瘤vs.胶质母细胞瘤）的治疗方案存在差异。

 

对于儿科病例，诊断变更未对临床管理产生影响，因为DNA甲基化分类未改变WHO分级。因此，这些患者的预后或治疗策略保持不变（如节细胞胶质瘤vs.毛细胞型星形细胞瘤）。既往研究报道，DNA甲基化分类在5%至15%的病例中影响临床决策。

当分类器对病例的分类置信度不高（置信分数CS在0.3至0.84之间）时，解读会更具挑战性，只能获得诊断提示。然而，这些结果仍可能提供有价值的数据，尤其是与临床、影像学和分子特征（包括拷贝数变异CNV谱）结合时。在本研究中，24%的病例被分配至低CS的MC。这一发现与既往研究一致，报道率在22%-26%。值得注意的是，成人病例中低CS更为常见（39%），而儿科病例仅为9%。然而，文献中专门针对儿童中枢神经系统肿瘤DNA甲基化的研究仍然有限。

 

研究者试图理解儿科和成人病例中DNA甲基化分类准确性的差异。有趣的是，Buckley等人强调，儿童中枢神经系统肿瘤的表观遗传背景与成人人群存在显著差异。事实上，与成人肿瘤相比，儿童肿瘤通常具有更低的突变负荷，而表观基因组广泛变异。成人人群中涉及DNA甲基化调控的基因突变可能更为少见。与常见IDH突变、EGFR信号通路变异或TERT启动子突变的成人中枢神经系统肿瘤不同，儿童肿瘤与组蛋白修饰的关联更为密切。这可能解释了为何DNA甲基化谱分析对儿童中枢神经系统肿瘤的分类尤为有效。

 

在成人人群中，低置信度匹配的病例中，57%的形态学诊断（在评分范围内）被DNA甲基化分类进一步确认。现有文献报道的该比例为30%至48%。这一信息很重要，因为它表明这些结果可纳入诊断考量，但需特别注意整合临床、形态学和分子数据。此外，这些结果可能提供改变患者临床管理的诊断信息，例如本队列中1例诊断为PPTID（垂体后叶肿瘤）的病例，通过DNA甲基化谱分析被分类为弥漫性儿科型高级别胶质瘤（RTK1亚型）。该诊断变更导致了截然不同的预后预测（中位总生存期14年vs.21个月）和治疗策略（单纯放疗vs.放疗联合同步化疗）。

与成人（8%）相比，儿科人群中“未分类”病例（CS<0.3）更多（15%）。文献中报道的“未分类”病例率在5%-35%。在本研究中，肿瘤定位不影响CS，因为“未分类”病例在中线和非中线肿瘤中分布均匀。尽管高级别肿瘤在“未分类”病例中更为普遍，但所有肿瘤类型均有涉及。有趣的是，对于高级别肿瘤，分子检测几乎在所有“未分类”病例中成功识别出分子变异，表明“分类器”未提供MC的原因并非肿瘤DNA缺失。

 

尽管DNA量充足，但某些病例仍无法与已知MC高度置信匹配，其原因尚未完全明确。已有研究表明，样本中肿瘤细胞的比例似乎是影响分类器CS的最关键因素。此外，Capper等人注意到，DNA甲基化数据的无监督聚类不受材料类型、芯片制备日期或组织来源等混杂因素的影响。如先前的研究所述，低CS可能与肿瘤罕见性或缺乏预先描述的肿瘤实体有关（与新实体的不断发现相关）。实际上，机器学习分类器通常存在局限性，例如性能高度依赖于训练数据，分类不平衡的影响显著。正如先前对髓内星形细胞瘤DNA甲基化谱的分析，另一项研究强调了DNA甲基化对罕见肿瘤的局限性，如NTRK融合胶质瘤，因为极少病例能与已知MC高度置信匹配。

这些病例的替代分子检测仍基于DNA/RNA分子检测，其所需DNA量少于DNA甲基化谱分析。如前所述，发现的分子变异可提供关键的诊断和治疗信息。此外，NCI/Bethesda分类器v2.0包含189个MC，其中17个未在海德堡分类器中描述（如具有假乳头状特征的高级别胶质瘤HPAP），可为“未分类”病例提供额外信息。

 

进一步分析CS与肿瘤类型的关系表明，成人室管膜瘤和儿童髓母细胞瘤/ATRTs最常被高置信度分类。在分子谱与DNA甲基化谱的相关性方面，值得注意的是，在多数通过常规诊断检测未发现分子变异的病例中，分类器提供了高置信度的MC。这强调了DNA甲基化分类在日常实践中对此类病例的附加价值。有趣的是，除1例脊髓室管膜瘤匹配于室管膜下瘤MC外，所有TERT启动子突变（单独或合并其他突变）的IDH野生型成人胶质瘤均匹配于IDH野生型胶质母细胞瘤MC。在弥漫性星形细胞瘤IDH野生型背景下，仅TERT启动子突变是否足以诊断为胶质母细胞瘤，仍为文献争议点。然而，本研究结果与WHO关于伴TERT启动子突变的弥漫性星形细胞瘤分类标准一致。

 

最后，DNA甲基化是识别新型肿瘤实体的特别有用工具，因为它为共享共同表观遗传特征的肿瘤提供了关键见解。本研究概述了两个未纳入当前WHO第5版分类的潜在新实体。“弥漫性胶质神经元肿瘤，A亚型”可能是一种新型组织分子实体，其形态学和分子特征与毛细胞型星形细胞瘤和DLGNT相似。该实体以KIAA1549-BRAF融合和1号染色体变异为特征，这一点尤其引人关注。据研究者所知，尚无关于该实体的文献报道，需要进一步研究确认其是否构成新的WHO实体。

关于“伴MN1:CXXC5融合的HGNET”MC，其被描述为新型肿瘤实体。值得注意的是，在当前WHO分类中，MN1变异的星形母细胞瘤与MN1基因与BEND2或CXXC5基因的融合相关。然而，MN1:BEND2和MN1:CXXC5融合肿瘤在DNA甲基化谱分析中相邻但聚类不同。新版DNA甲基化分类器（v12.8）包含两个不同的MC：“MN1变异的星形母细胞瘤（MN1-BEND2融合）”和“伴MN1:CXXC5融合的HGNET”，表明它们是不同的实体。

然而，为验证这些潜在新实体的识别，需遵循C-Impact NOW 2024标准，总结如下：（1）临床-放射学特异性；（2）基于大规模谱分析（如DNA甲基化谱、RNA蛋白表达谱或多组学数据集）的独特聚类模式；（3）识别包含单一或两种以上基因驱动变异或典型微观特征（包括免疫组化）的分子谱。这意味着需要对更多病例进行额外研究，包括进一步的分子表征。

 

尽管DNA甲基化分类在日常实践中具有诸多优势，但其仍存在局限性，如所需DNA量（本研究中9%的病例因DNA不足未纳入，数据未显示）和较长的周转时间（TAT），这是该技术的固有问题。在不进行DNA甲基化谱分析的实验室中，TAT尤其长，导致检测需外包至其他实验室。根据经验，TAT为1至2个月。这凸显了形态学分析和分子谱分析在日常实践中仍有一席之地，尤其是对于需要尽快启动治疗的高级别肿瘤。改善TAT的策略包括修改诊断流程，例如应尽早进行DNA甲基化谱分析的DNA提取，例如与免疫组化检测同时进行，这可显著节省时间。样本检测优先级也至关重要，如儿科和高级别肿瘤应优先检测。

其他分子技术，如RNA和DNA测序或FISH，分别用于检测融合和重复、突变和拷贝数变异和融合，可作为替代分子检测手段。与DNA甲基化谱分析相比，这些技术更快、成本更低（对于DNA测序和FISH），且所需DNA量更少（DNA甲基化检测需要250-500 ng）。尽管它们无法将肿瘤分配至特定MC，但可提供关键的补充诊断、预后和治疗信息，尤其是针对靶向治疗。

总之，本研究证实，DNA甲基化分类为中枢神经系统肿瘤诊断提供了显著的附加价值，尤其是在儿科病例中。即使是低置信度的DNA甲基化分类也能产生重要的诊断信息。因此，DNA甲基化谱分析应系统整合到肿瘤亚型分型的日常实践中，尤其是对于疑难病例和儿童中枢神经系统肿瘤。此外，DNA甲基化谱分析为识别共享表观遗传特征的新肿瘤实体提供了令人兴奋的机会，为该领域的进一步研究铺平了道路。

参考文献：

Lebrun L, Gilis N, Dausort M, et al. Diagnostic impact of DNA methylation classification in adult and pediatric CNS tumors. Sci Rep. 2025;15(1):2857. Published 2025 Jan 22. doi:10.1038/s41598-025-87079-4

Tags： DNA甲基化分类辅助成人和儿童中枢神经系统肿瘤的精准诊断和亚型细化，部分修改初始诊断和WHO分级