鼻咽癌作为一种与EB病毒密切相关的头颈部恶性肿瘤，在特定地理区域如东南亚和华南地区高发，其治疗面临复发和转移的挑战，免疫治疗因此成为研究热点。在肿瘤免疫监视中，细胞毒性T淋巴细胞扮演着关键角色，能够识别并清除表达肿瘤特异性抗原的癌细胞，然而肿瘤细胞通过多种机制实现免疫逃避，例如下调主要组织相容性复合体表达、分泌免疫抑制因子或利用免疫检查点通路。LGALS9即galectin 9，是一种β-半乳糖苷结合凝集素，广泛参与细胞粘附、凋亡和免疫调节，在多种肿瘤中过表达并与不良预后相关，但其在鼻咽癌中的具体作用机制尚未完全阐明。自噬作为细胞内部的一种高度保守的分解代谢过程，通过溶酶体降解受损细胞器和蛋白质以维持稳态，在肿瘤发展中具有双重性，既可帮助细胞应对代谢压力促进存活，又可能影响抗原呈递和T细胞功能。近年来，研究表明LGALS9可能与自噬途径相互作用，进而调制肿瘤微环境中的免疫应答，这为探索鼻咽癌免疫治疗新策略提供了重要方向。

为了深入探讨LGALS9在鼻咽癌免疫逃避中的功能及其与自噬的关联，Kam等研究人员开展了一系列严谨的体外实验。他们选用人鼻咽癌细胞系，通过慢病毒载体介导的RNA干扰技术构建LGALS9稳定敲低模型，同时利用质粒过表达系统获得LGALS9高表达细胞，并通过实时定量PCR和Western blot验证操作效果。细胞毒性T淋巴细胞从健康供者外周血单核细胞中分离，经抗CD3/CD28抗体和白细胞介素-2激活扩增，获得纯化的CD8阳性T细胞群体。在共培养实验中，效应细胞与靶细胞按不同比例混合培养，模拟体内免疫相互作用，通过乳酸脱氢酶释放实验和流式细胞术检测 Annexin V/碘化丙啶染色来定量细胞毒性T淋巴细胞的杀伤效率。免疫突触的形成和功能通过高分辨率共聚焦显微镜观察，使用特异性荧光抗体标记T细胞受体和溶酶体相关膜蛋白CD107a，以分析lytic granules的释放动态。为进一步揭示分子机制，研究人员采用定量蛋白质组学方法，通过液相色谱-串联质谱技术比较LGALS9修饰细胞与对照细胞在共培养条件下的全蛋白质表达谱，利用生物信息学工具进行通路富集分析，重点关注自噬相关蛋白如微管相关蛋白1轻链3和选择性自噬接头p62的表达变化。

自噬通量的精确测量结合了多种方法，包括在有无溶酶体抑制剂巴弗洛霉素A1存在下通过Western blot检测LC3-II的转化率和p62的降解水平，以及利用mRFP-GFP-LC3双荧光报告系统在共聚焦显微镜下量化自噬体与溶酶体融合事件。此外，研究应用了三种自噬抑制剂处理LGALS9过表达细胞，N-乙酰半胱氨酸作为活性氧清除剂干扰自噬起始阶段，氯喹通过提高溶酶体pH值阻断自噬体降解，而胃蛋白酶抑制剂A则抑制天冬氨酸蛋白酶活性影响溶酶体功能，各抑制剂使用浓度均通过前期剂量反应实验优化确定。细胞增殖能力通过CCK-8法检测吸光度值评估，持续监测五天内细胞生长曲线。肿瘤形成潜能则通过体外软琼脂克隆形成实验和体内裸鼠异种移植模型验证，皮下注射细胞后定期测量肿瘤体积并最终称重，组织样本进行苏木精-伊红染色和免疫组化分析以评估细胞增殖和凋亡指标。

实验结果表明，LGALS9在鼻咽癌细胞中的过表达显著削弱了细胞毒性T淋巴细胞的抗肿瘤功能。在共培养体系中，与对照细胞相比，LGALS9高表达细胞与T细胞形成的免疫突触中lytic granules的释放效率降低约50%，具体表现为CD107a表面表达下降和颗粒酶B活性减弱，导致癌细胞凋亡率显著减少。相反，当LGALS9被敲低后，T细胞的脱颗粒过程和杀伤能力基本恢复，证实LGALS9是抑制免疫应答的关键因子。质谱蛋白质组学分析显示，LGALS9过表达细胞中自噬调控通路显著富集，多种自噬相关蛋白如ATG5、ATG7和LC3B表达上调2至3倍，同时自噬通量增加约1.5倍，表明自噬途径被激活。这些变化在LGALS9敲低细胞中逆转，自噬蛋白表达水平和通量均回落至基线。

当使用自噬抑制剂处理LGALS9过表达细胞时，自噬相关蛋白表达受到抑制，自噬通量被有效阻断，例如氯喹处理导致LC3-II积累减少和p62蛋白水平回升。功能上，自噬抑制显著降低了鼻咽癌细胞的恶性表型，N-乙酰半胱氨酸和氯喹分别使细胞增殖率下降30%和40%，软琼脂实验中克隆形成数减少约50%。在裸鼠移植瘤模型中，LGALS9过表达组肿瘤生长迅速，四周后体积达500立方毫米，而联合氯喹处理组肿瘤体积仅200立方毫米，重量减轻60%，组织学分析显示处理组凋亡细胞增多且增殖标志物Ki-67表达下降。这些数据表明，自活化在LGALS9介导的免疫抑制中起核心作用，抑制自噬不仅能直接限制肿瘤生长，还能间接恢复T细胞的杀伤效能。此外，研究人员注意到自噬抑制可能影响免疫突触的稳定性，延长T细胞与靶细胞的接触时间，但这一现象的具体分子基础仍需深入探索。

总之，本研究系统揭示了LGALS9通过激活自噬通路促进鼻咽癌免疫逃避的机制，为联合靶向治疗提供了理论依据。自噬抑制在LGALS9高表达肿瘤中能够解除对细胞毒性T淋巴细胞的压制，增强免疫介导的肿瘤清除，这尤其对于过继性T细胞疗法具有启示意义。当前基于EB病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞的过继疗法在鼻咽癌临床应用中效果有限，部分归因于肿瘤微环境的抑制因素，如LGALS9上调及自噬活化。因此，将自噬抑制剂如氯喹与过继疗法结合，可能改善T细胞浸润和功能，提高治疗响应。然而，该研究主要基于细胞和动物模型，需在患者组织样本中进一步验证LGALS9表达与自噬活性的临床相关性，并评估抑制剂的安全性。肿瘤微环境中其他细胞如肿瘤相关巨噬细胞可通过物理阻碍限制T细胞移动，与LGALS9机制可能协同作用，未来治疗策略应考虑多靶点干预，例如自噬抑制与PD-1阻断联用。同时，自噬在T细胞自身稳态中的作用也不容忽视，长期抑制可能影响效应细胞存活和记忆形成，需在疗程设计中权衡利弊。总体而言，这项研究深化了对肿瘤免疫代谢的理解，推动了精准免疫治疗的发展。

原始出处：

Clarence Pascual & Daniel J. Klionsky (2025) Autophagy inhibition in LGALS9-overexpressing nasopharyngeal carcinoma unleashes immune response, Autophagy, 21:10, 2089-2090, DOI: 10.1080/15548627.2025.2534072

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Tags： 揪出鼻咽癌 “免疫逃犯”！新研究发现，LGALS9 靠激活自噬，让抗癌 T 细胞直接 “失能”