近年来，日益增长的微生物耐药问题已对人类健康构成严重威胁。早在2011年，世界卫生组织即提出遏制微生物耐药口号：“今天不采取行动，明天就无药可用！”G20峰会多次提及细菌耐药问题，迄今为止，“世界提高抗微生物药物认识周”的宣传已持续开展10年。我国相关部门亦颁布了一系列政策，采取多项有效举措遏制微生物耐药的发展。由此可见，全球对于微生物耐药的严重性和迫切性已达成共识。减少微生物耐药，合理使用抗菌药物是关键。

然而，传统微生物培养技术和药敏检测流程需2～3 d甚至更久才能提供药敏结果，很大程度上限制了临床医生对抗菌药物的正确选用，也不利于患者的救治。对于经验性抗菌药物治疗无效的患者，每延迟1 h给予正确药物，死亡率即会增加10%^[1]。因此，探索快速准确的药敏检测方法，对于医生合理使用抗菌药物、患者及时有效治疗以及减缓/降低微生物耐药的发展均具有重要作用。

随着基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）在临床上的应用，微生物鉴定时间已由小时缩短为以分钟计算，但药敏检测时间却未明显改善。多项研究通过不同方法收集细菌，替代药敏检测前菌落生长过程。例如，使用4～6 h培养后的菌膜^[2]、短时增菌制备药敏用菌悬液^[3]、离心富集细菌直接进入药敏检测流程^[4]等，以缩短药敏检测报告时间。

上述方法虽然有一定效果，但并未从根本上改变药敏试验现状。欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）和美国临床实验室标准化协会（CLSI）分别于2018年和2021年推出纸片法血培养阳性瓶直接快速药敏试验（RAST）方案^[5-6]，EUCAST方案可在4～8 h获得药敏结果，CLSI方案则至少需要8～10 h。

因RAST方法需配备方法学专属折点，目前只能用于常见革兰阴性杆菌（大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌等）和阳性球菌（EUCAST有关于金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌和屎肠球菌的RAST折点，CLSI尚无阳性球菌的RAST折点），限制了向其他细菌和药物推广。

荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）、基因芯片和全基因组测序等分子生物学技术，以及以胶体金免疫层析法为主的免疫学技术虽可在几小时或几分钟内获得药敏检测结果，但其仅针对特殊耐药基因及蛋白，无法检测新的或不典型的耐药病原菌。因此，若要开发普适于临床常见病原菌所有药敏试验的RAST方法和检测设备，在保证准确的前提下大幅缩短检测时间，则需转换思路，另辟蹊径，进行颠覆性的变革。

本文介绍几种快速药敏检测新方法，其主要原理是将观察微生物生长的时间点前移，在药敏孵育早期肉眼不可见时，借用不同的设备和技术捕捉微生物数量、形态、代谢等变化规律，得出微生物与抗菌药物之间的耐受关系。

1 观察微生物的生长现象

1.1 电阻抗单细胞计数法

微量肉汤稀释法药敏试验仅孵育2 h，即可通过电阻抗单细胞计数法得知细菌的生长情况。检测池内通过正负电极产生稳定的电流，探针自动吸取菌液进入检测池，当菌液中的细菌通过电极间的小孔时，电阻增高，引起瞬间电压变化形成脉冲信号，达到计数的目的，也可通过脉冲振幅的大小评估细菌的体积。根据每个药敏孔检测结果，计算得到药物的最低抑菌浓度（MIC）^[7]。该技术除能检测纯培养的菌落外，还可直接检测血培养阳性标本和单纯性尿路感染患者的尿液标本。

1.2 单细胞形态分析技术

通过光学技术追踪单个病原微生物细胞的形态变化，再通过算法对图像进行处理，可得到抗菌药物的药敏数据。对于单个细胞的追踪可通过调节微流控系统的流体阀配合光学检测来实现，最短30 min可获得药物的MIC值^[8-9]。将微生物固定于含药的琼脂糖凝胶中，通过显微镜对其进行拍摄成像，3～4 h可获得药敏结果^[10]。Zhang 等^[11]通过散射成像系统直接追踪尿液标本中单个细菌的分裂过程，1 h内即可获得药敏结果。还有研究者提出微流控芯片中基于单细胞水平的药敏检测技术，可在2 h内完成对7种细菌混合样本的药敏检测^[12]。

1.3 显微自动聚焦技术

在传统稀释法药敏的基础上，通过显微自动聚焦技术进行显微拍摄，每小时动态监测微生物的数量和形态变化。通过算法和数据库比对，可在2～8 h内报告药物的MIC值。该方法检测阴性杆菌、葡萄球菌、肠球菌和链球菌等多种细菌，均获得了较好结果，相关验证数据尚待发布。

2 荧光标记显示细胞活性

荧光标记显示细胞活性是将系列稀释的抗菌药物与病原微生物进行共同孵育后，通过荧光物质标记细菌细胞中的特殊成份，用荧光显微镜或流式细胞仪检测荧光的变化，从而获得药敏结果。

2.1 三磷酸腺苷生物发光法

三磷酸腺苷（ATP）普遍存在于所有活的生物体内，是能量的主要来源。微生物细胞中ATP的含量基本稳定。荧光素酶是一种最初发现于萤火虫的酶类，能催化荧光素氧化并产生生物光。在这种催化反应中，ATP是必不可少的底物。当荧光素的量足够时，荧光素酶催化反应产生的荧光强度与游离的ATP成正比^[13]。

国外有学者将ATP生物发光的原理用于快速药敏检测^[14]，2 h即可获得药物MIC值，检测限为10³ CFU/mL。该研究先将微生物裂解提取ATP，再进行检测，操作比较复杂。国内向杰等^[15]未进行ATP提取，而是在检测过程中将抗菌药物分为生长依赖型（抑菌剂）和致死依赖型（杀菌剂），分别采用不同的结果判断方法，其得到的快速药敏结果与微量肉汤稀释法的基本一致性（EA）和分类一致性（CA）分别达90%和80%～84%，检测周期由16～24 h缩短为5～6 h。刘君等^[16]将该方法用于结核分枝杆菌的药敏检测，在（6.6±2.1）d内获得药敏结果，与罗氏培养法符合率达到95.2%。

2.2 荧光细胞染色法

荧光细胞染色法旨在利用荧光染料的渗透性和指示性区分不同状态的细菌细胞，获得细菌-抗菌药物孵育体系中细胞活性信息，从而推算出药物的MIC值。

荧光染料SYBR GreenⅠ可进入活体细胞内，使细胞呈现绿色。碘化丙啶无法进入活体细胞，只能进入细胞膜受损的细胞或死亡细胞内，使细胞呈现红色。通过荧光显微镜和荧光分析仪测得绿/红荧光比值，即能标记细菌种群的存活状态。Zhang等^[17] 和Feng等^[18]利用上述特点，均在30～60 min内获得了快生长病原微生物的药敏结果。

刃天青常被作为氧化还原指示剂，用于牛奶中微生物的检测。在被充分氧化的情况下，刃天青呈现蓝色，还原条件下会不可逆地转化为粉红色的荧光产物试卤灵。细菌繁殖过程中，细胞内处于还原状态，摄入细胞内的刃天青被还原为试卤灵后释放至细胞外的培养基中，使培养基由蓝色变为粉红色，其荧光强度与活性细胞数成正比。该方法最快可在2 h内获得细菌的药敏结果^[19]，缺点是刃天青无法被非发酵革兰阴性杆菌所代谢，因此其使用受到一定限制。基于刃天青还原法的微流体芯片，用于尿液中分离细菌的检测，可在6 h内获得药物的MIC值^[20]。

2.3 qPCR检测细菌16S rDNA

细菌与抗菌药物共同孵育的过程中，蛋白质在4 h出现变化，而RNA和DNA在2 h即显现明显的变化。考虑到RNA的易降解性，使用通用引物进行16S rDNA检测更有应用前景。中国科学院武汉病毒研究所罗俊博士利用qPCR方法，检测与抗菌药物共同孵育过的细菌16S rDNA，通过核酸拷贝数变化进行快速药敏检测。其采用该方法对36株铜绿假单胞菌和28株金黄色葡萄球菌进行药敏检测，结果与标准方法的一致性分别达到97.22%和96.43%^[21]。Xie等^[22]也利用qPCR方法在孵育2 h后成功检测了鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌的敏感性。

3 检测细胞代谢状态/产物

3.1 代谢产物显色法

细菌在生长过程中会释放挥发性有机化合物，如胺类、醛类、芳香族化合物、酮类、酯类等，可通过每个药敏检测孔上方化学小分子感受器颜色的变化，感知这些物质的产生。进行药敏检测的仪器每10分钟扫描1次，检测感受器的颜色，从而能够在最早时间点区分有细菌生长与无细菌生长的药敏孔，得到药物的MIC值。Antonelli等^[23]使用基于此方法的平台直接检测革兰阴性杆菌血培养肉汤，平均获得药敏检测结果的时间为4.6 h，比传统药敏结果回报时间快24～48 h。此外，血培养显示阳性后16 h内的肉汤均可使用，可检测16～22种抗菌药物，包括头孢他啶/阿维巴坦、头孢洛扎/他唑巴坦、美罗培南/韦博巴坦等新型药物。

3.2 拉曼光谱

光通过介质发生散射，极少数光子除在方向上发生变化外，还会与介质分子发生能量交换，使散射光的频率发生变化，这种现象称为拉曼散射。经过光谱仪的色散和探测器采集后获得光谱，即称为拉曼光谱。通过对拉曼光谱中峰的位置、飘移、宽度、强度等信息进行研究，可实现对样品的定性和定量分析。目前，拉曼光谱已被广泛应用于生物化学、安检/安防和考古探测等多个领域。

病原菌细胞内的核酸、蛋白质、脂质等分子均可通过拉曼光谱进行显示，且光谱的强度与分子在细胞内的含量成正比。微生物在抗菌药物作用后，会发生物质组成、代谢产物变化，拉曼光谱技术可检测到这些变化，从而确定抗菌药物对微生物的效果。由于光谱是微生物自发释放的，因此把该类方法归为拉曼药敏技术的非标记检测法^[24]。

将重水（D₂O）掺入药敏培养基中，使其作为标记物参与细菌代谢，再对其特征峰进行检测，是拉曼光谱技术的标记方法，亦是目前研究较多的拉曼药敏检测方法。重水中的氘参与微生物中重要生物大分子的合成，在拉曼光谱的生物静默区出现一个明显的C-D峰，峰的强度与细菌的代谢活性呈正相关^[25]。

通用检测步骤为：先将细菌在不同浓度抗菌药物中孵育1～2 h，向培养基中加入D₂O(浓度一般为30%～100%)，继续孵育30 min左右进行检测，即可根据C-D峰判断细菌对抗菌药物的活性，筛选出有效药物^[26]。此方法不仅可用于纯菌落的药敏检测，还可直接检测临床标本，无需进行培养、染色或其他标记。该方法对尿液标本的药敏检测仅需2.5 h，远快于传统方法（48 h），对于无法培养或难培养微生物的药敏检测具有重要意义^[27]。

4 基于MALDI-TOF MS的快速药敏

4.1 分析抗菌药物水解产物的质谱峰

基于细菌和药物孵育的过程中，产酶的菌株可水解抗菌药物，使其结构发生改变，此方法可用于评估细菌所产生的水解酶对于抗菌药物的水解能力，如药物被水解，则说明该药物耐药。一般来说，抗菌药物可通过添加1个质子、增加K⁺/Na⁺、脱羧、脱羰基等方式使结构发生改变，分子量也随之变化，这种变化能够通过质谱检测出来。

与鉴定用质谱的检测范围（2000～20 000 Da）不同，抗菌药物及其降解产物的质量范围通常为100～1000 Da。该方法可在2.5～3 h内检测到脆弱拟杆菌产生的碳青霉烯酶^[28]。检测从血培养中分离的铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和肠杆菌目细菌产生的碳青霉烯酶时，则用时更短，仅需30～60 min^[29]。

4.2 鉴定与耐药性相关的特定蛋白质谱峰

由已知耐药基因产生的特征性耐药蛋白分子（如分子量在2000～20 000 Da范围内），可通过识别质谱谱图中的特异峰，确认病原菌是否存在耐药机制，以此评价细菌的耐药性。有研究者发现肺炎克雷伯菌谱图中位于11 109 Da的峰与其产生的肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）相关^[30]，金黄色葡萄球菌谱图中的PSM-mec肽与甲氧西林耐药有关^[31]，脆弱拟杆菌谱图中位于4000～5500 Da之间一系列峰的变化可区别cfiA阳性和cfiA阴性的菌株^[32]。质谱特征峰的耐药监测方法较复杂，专业性强，对于检测者的要求高，需要比较成熟的算法进行后台处理。

4.3 基于微生物生长情况的表型快速药敏试验

将药物与微生物共同孵育4 h后（根据菌种的不同有所变化）取出培养物，离心后弃上清液，沉淀物进行质谱鉴定。若能得到准确的鉴定结果，说明细菌蛋白质谱峰完整，细菌未被抗菌药物抑制，生长状态良好，反之则说明细菌被抑制，无足够的蛋白质形成谱图用于鉴定。根据不同孵育孔内细菌的鉴定结果，获得细菌的药敏结果。张龙桃等^[33]应用该方法检测肺炎克雷伯菌的敏感性，当菌液含量为 6×10⁶ CFU/mL时，检测亚胺培南和替加环素的最佳孵育时间分别为2 h和3 h，与微量肉汤稀释法的EA均为98.33%。

5 小结

一项新的快速药敏检测技术从实验室走向临床，能够得到普遍认可并大规模使用，除需具备快速、准确和稳定检测的特点外，普适性和易操作性也很重要。

普适性是说检测方法适合于大部分常见菌株对常见药物的敏感性，而不局限于检测一类耐药机制。易操作性是指该方法可通过自动化、智能化设备及流程实现操作步骤和结果汇报的便捷性。基于上述临床需求，部分检测方法，如代谢产物显色法、电阻抗单细胞计数法、显微自动聚焦技术，已有自动化检测设备上市，实现了临床操作的便捷性。

其他方法，如拉曼光谱，检测设备已处于研发和临床试验阶段。而本文中提到的大部分方法，仍需进一步完善和验证。例如，基于MALDI-TOF MS的3种快速药敏方法中，基于微生物生长情况的方法更具普适性。鉴定耐药特定蛋白峰的方法，因其仅可特异性检测特定耐药机制中的蛋白而导致使用场景受限。

分析抗菌药物水解产物质谱峰的方法，操作者需更加了解抗菌药物的结构和特点，且实验室应配备更多质谱仪，具体原因：若与鉴定使用同一台质谱仪，需频繁更换检测范围，不利于质谱仪的稳定性。通过荧光标记进行快速药敏检测的几种方法，看起来均具有普适性，但需研发相应的检测设备以降低临床操作难度，并保证结果的一致性。其中，基于qPCR的检测方法可能增加检测一体机的研发难度。

在全球科技快速发展的今天，传统药敏检测方案势必会被取代，快速药敏方法有望成为临床微生物实验室药敏检测的主流。希望这些技术能够尽快走向临床，被微生物实验室和临床医生接受，真正发挥其方便医生、造福感染性疾病患者的作用。

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