类风湿关节炎（RA）被公认为“不死的癌症”，其晨僵、对称性关节肿痛与进行性骨破坏不仅造成劳动力丧失，更带来沉重的社会医疗负担。现有化学合成缓解病情抗风湿药（csDMARDs）、生物制剂（bDMARDs）与靶向合成药物（tsDMARDs）虽能延缓结构损伤，但亚太多中心真实世界数据显示临床缓解率仅17.1%—62.3%，且因感染、肝肾毒性或心血管事件等副作用，超过半数患者被迫换药或停药。近年来，2017年诺贝尔生理学或医学奖将“昼夜节律”推至前台，免疫系统的昼夜波动被证实与RA患者清晨症状高峰密切相关；然而能够兼顾“免疫-节律”双环节、且符合东方人群用药习惯的治疗策略尚属空白。

源于东汉张仲景《金匮要略》的桂枝芍药知母汤（GSZD）由九味草本组成，临床加味使用逾千年，Meta分析已证实其联用甲氨蝶呤可显著提高ACR20/50应答并缩短晨僵时间，但缺少现代科学语言阐释其“因时制宜”之谜。

广州中医药大学第二附属医院团队在国家重点研发计划与岐黄工程支持下，首次把GSZD置于“昼夜节律-免疫稳态”坐标系，从临床到动物、从细胞到基因层面连续求证，为RA的“时间治疗学”提供了中医方案。

图1 论文首图

类风湿关节炎中差异表达的昼夜节律基因及其相关炎症因子的鉴定

研究纳入2023年6月至2024年12月就诊的40例活动期RA患者及40例健康志愿者，按晨（06:00）/暮（18:00）两个疾病活动极点采集外周血单个核细胞（PBMCs）与血浆。高通量PCR芯片显示，90条核心昼夜基因中77条在RA群体呈显著差异表达，其中06:00时43条上调、34条下调，18:00时仅3条上调、50条下调，提示RA患者的分子钟在清晨“过度点火”而傍晚“过早熄火”。核心钟基因NR1D1（又称Rev-erbα）变化幅度最大，其在健康人06:00表达达峰，而RA患者恰呈“谷值”，二者相差4.3倍；另两条抑制性钟基因BMAL1、CRY1则在RA清晨显著升高，与NR1D1形成“倒置相”。转录组交互网络分析提示NR1D1处于枢纽节点，可直接抑制RORγt及NF-κB下游炎症模块。同步进行的Luminex多因子检测证实，RA患者06:00血浆IL-1β、IL-5、IL-17、MMP13显著高于傍晚，且与NR1D1表达呈负相关；而抗炎因子IL-10与NR1D1正相关。由此提出假说：NR1D1清晨低表达可能是RA昼夜炎症失衡的“启动扳机”，恢复其节律有望成为新的干预靶点。

图2 类风湿关节炎中差异表达的昼夜节律基因及其相关炎症因子的鉴定

桂枝芍药知母汤对佐剂性关节炎具有抗炎和抗骨破坏作用

为验证GSZD“重塑节律”是否产生关节保护，团队先建立经典弗氏佐剂大鼠关节炎（AIA）模型，设空白、模型、甲氨蝶呤（0.3 mg/kg）及GSZD低（4.65 g/kg）、中（9.3 g/kg）、高（18.6 g/kg）剂量组，均每日10:00灌胃。结果GSZD高剂量组足肿胀度、关节炎指数及骨微结构CT评分分别下降48%、52%和61%，骨密度（BMD）、骨小梁数量（Tb.N）接近空白水平；脾脏指数回降提示全身炎症缓解。血清ALT/AST检测未见药物性肝损，而甲氨蝶呤组ALT显著升高，显示GSZD安全性更优。ELISA表明GSZD以剂量依赖方式降低TNF-α、IL-1β、IL-18、IL-6及IL-17，其中高剂量对IL-1β的抑制率可达63%，优于化学对照。病理HE、Safranin O-Fast Green及Masson染色均见滑膜增生、软骨侵蚀与骨小梁断裂被显著遏制。以上结果首先回答了“GSZD是否有效”的问题，为后续机制探索奠定了坚实的药效学基石。

图3 桂枝芍药知母汤对佐剂性关节炎具有抗炎和抗骨破坏作用

桂枝芍药知母汤通过激活NR1D1基因并抑制NLRP3通路发挥抗关节炎作用

借助AIA大鼠PBMCs与脾脏组织，作者进一步检测钟基因表达。模型组NR1D1 mRNA下降至空白组的42%，而GSZD高剂量使其回升至正常的1.5倍；蛋白水平亦呈同步增加。相反，炎症小体NLRP3及其下游IL-1β、IL-18在模型组异常高表达，GSZD处理后显著下调。敲除实验采用siRNA沉默NR1D1后，即使加入GSZD含药血清，NLRP3、IL-1β、IL-18的mRNA与蛋白水平均不再被抑制，表明NR1D1是GSZD发挥抗炎作用的“守门人”。染色质免疫共沉淀（ChIP-qPCR）亦证实NR1D1可直接结合NLRP3启动子区E-box元件，负向调控其转录。由此提出GSZD“激活NR1D1—钳制NLRP3—削减IL-1β/IL-18”轴线的分子序列，为经典名方注入了现代靶点内涵。

图4 桂枝芍药知母汤通过激活NR1D1基因并抑制NLRP3通路发挥抗关节炎作用

桂枝芍药知母汤的定时给药通过调节NR1D1对佐剂性关节炎症状产生不同影响

既然NR1D1表达具有24h振荡，GSZD是否“因时施效”？研究设置10:00与22:00两个给药窗口，剂量统一为18.6 g/kg。4周后，10:00组足体积、关节炎评分及微CT总分均显著优于22:00组，差异分别达24%、31%与28%；脾脏指数和滑膜病理亦以晨给组更佳。血清IL-1β、IL-18、IL-17在10:00组下降幅度分别比22:00组多12%、15%与10%。qPCR与Western blot显示，10:00给药可同步抬高NR1D1振幅并压低NLRP3，而22:00给药对NR1D1的提升作用不足50%。由于大鼠为夜行性动物，其炎症峰值在14:00，相当于人类06:00，因此10:00给药恰为“病前干预”，可理解为中医“治未病”的时辰注解，也为临床指导RA患者清晨服药提供了实验依据。

图5 桂枝芍药知母汤的定时给药通过调节NR1D1对佐剂性关节炎症状产生不同影响

桂枝芍药知母汤通过激活NR1D1抑制NLRP3-IL-18/IL-1β信号通路

体外实验采用小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）M1极化模型，以LPS+IFN-γ刺激后分别给予空白血清、甲氨蝶呤、GSZD含药血清（10%、5%、2.5%）及NR1D1激动剂SR9009。GSZD高剂量使NR1D1 mRNA升高2.1倍，NLRP3、IL-1β、IL-18则分别下降58%、54%与49%，效果与SR9009相当。Western blot亦显示GSZD呈剂量依赖地上调NR1D1蛋白，同时下调NLRP3及成熟IL-1β p17片段。在破骨细胞模型中，GSZD显著抑制TRAP阳性细胞数目及骨吸收陷窝形成，并降低MMP9、CTSK、ACP5等骨破坏基因表达，提示其通过同一通路兼具“抗炎-抗破骨”双重效应。

图6 桂枝芍药知母汤通过激活NR1D1抑制NLRP3-IL-18/IL-1β信号通路

桂枝芍药知母汤的抗炎作用依赖于NR1D1介导的对NLRP3/IL-18/IL-1β信号通路的抑制

为了最终确认“NR1D1是否为不可绕过的核心”，团队构建NR1D1-/-C57BL/6小鼠并从BMDMs建立M1模型。结果在野生型细胞中，GSZD与SR9009均能逆转LPS/IFN-γ诱导的NR1D1下降及NLRP3、IL-1β、IL-18升高；而在NR1D1-/-细胞中，GSZD完全丧失对上述分子的调控能力，ELISA亦显示IL-6、TNF-α、IL-17虽部分下降，但IL-1β、IL-18无显著变化，说明下游细胞因子网络因“主开关”缺失而解体。综合siRNA与基因敲除双重证据，研究无可辩驳地证明：GSZD的抗炎与骨保护效应必须依赖NR1D1的正常表达，其分子逻辑为“GSZD→NR1D1↑→NLRP3/IL-1β/IL-18↓→炎症与骨破坏受抑”。

图7 桂枝芍药知母汤的抗炎作用依赖于NR1D1介导的对NLRP3/IL-18/IL-1β信号通路的抑制

小结

该研究首次用现代节律生物学语言诠释了桂枝芍药知母汤“因时制宜”的科学内涵，将NR1D1-NLRP3-IL-1β/IL-18轴确立为其中医特色机制靶点，为RA的时辰治疗提供了可视化的分子路线图。未来仍需多中心、大样本临床试验验证清晨服药的优越性，并借助代谢组学与宏基因组学进一步解析九味草药对宿主-微生物共节律的影响。随着“时间生物学+中医药”交叉研究的深入，以GSZD为代表的经典方剂有望在全球风湿病诊疗指南中占据一席之地，让更多RA患者在朝阳初升之时迎来关节的轻松与生活的希望。

参考文献：

He X, Li R, He X, He F, Xiao Y, Chen X, Lai Y, Guo W, Liu P, Cai X, Yang X, Shu Y, Shao J, Chen Y, Chen D, Quan M, Wu J, Xian L, He J, Ren H, Chen Z, Zhong Z, Liu L, Pan H. Elucidation of the anti-arthritic mechanism of Guizhi-Shaoyao-Zhimu decoction by reshaping circadian rhythm. Pharmacol Res. 2025 Jun;216:107787. doi: 10.1016/j.phrs.2025.107787. Epub 2025 May 22. PMID: 40412782.

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