近年来，肿瘤免疫治疗虽取得突破性进展，但原发性及获得性耐药仍是临床面临的巨大挑战。中国科学院上海药物研究所郑明月/张素林团队联合盐城市第一人民医院耿炜团队，于2025年6月4日在Science Translational Medicine在线发表题为“Methotrexate exerts antitumor immune activity and improves the clinical efficacy of immunotherapy in patients with solid tumors”的研究，首次揭示了经典免疫抑制剂甲氨蝶呤（MTX）在肿瘤免疫中的全新作用机制。

该研究通过人工智能技术精准预测并实验证实MTX对肿瘤微环境中特异性靶点ENPP1的抑制作用，展开了一条将老药新用推动肿瘤免疫治疗升级的创新路径。与此同时，低剂量MTX在小鼠模型和临床患者中均表现出显著增强免疫检查点抑制剂（ICB）和放射治疗（RT）抗肿瘤效果的潜力，为临床肿瘤治疗方案的优化提供了坚实理论基础和实践支持。

一、研究背景与意义

免疫疗法依赖于激活免疫系统识别并消灭肿瘤细胞，cGAS-STING信号通路在此过程中起关键作用。cGAS（细胞质环状GMP-AMP合成酶）识别胞质DNA，合成第二信使cGAMP，进而激活STING，诱导I型干扰素及炎症因子产生，促进免疫细胞浸润和抗原呈递，增强肿瘤免疫应答。尽管STING通路是理想的治疗靶点，但因STING广泛表达于全身组织，直接激活存在显著免疫毒性风险。电喷雾酶-磷酸酯酶1（ENPP1）作为cGAMP的水解酶，在多种肿瘤中过表达，能负向调控STING信号，限制抗肿瘤免疫反应。特异性抑制ENPP1，有望在肿瘤微环境中实现STING通路的选择性激活，兼顾疗效与安全。

此前，郑明月团队基于微扰转录组数据，构建了孪生谱图卷积网络（SSGCN）人工智能模型，预示MTX可能具备ENPP1抑制活性。甲氨蝶呤作为经典叶酸拮抗剂，长期用于治疗肿瘤及类风湿性关节炎。本研究基于AI预测，深入探讨MTX在肿瘤微环境中的免疫激活作用，首次发现其兼具诱导肿瘤细胞cGAMP生成和抑制ENPP1介导cGAMP水解的双重免疫调节功能。

二、关键发现与机制解析

叶酸拮抗剂中MTX展现ENPP1抑制活性

研究针对人源和鼠源ENPP1开展体外酶学活性测试，多个叶酸拮抗剂均表现抑制能力，其中MTX最为显著，IC50分别为0.16 μM和0.57 μM，优于商用ENPP1抑制剂（ENPP1-IN-1）。蛋白质稳定性和核磁共振分析确认MTX能与ENPP1直接结合，增强蛋白热稳定性，且结合表现为剂量依赖性。

MTX与ENPP1底物结合口袋竞争性结合

通过等温滴定量热法（ITC）和酶动力学研究，证实MTX以竞争性方式结合ENPP1底物结合口袋，血交质谱（HDX-MS）进一步揭示MTX与残基Phe257、Tyr340等形成多个氢键和π-π相互作用。关键活性位点突变实验验证了MTX结合与催化活性抑制的依赖关系，显示MTX对ENPP1高度选择性，对同源蛋白ENPP2/3无抑制活性。

MTX抑制胞外cGAMP水解，增强STING信号

细胞实验显示，MTX有效阻止ENPP1介导的胞外cGAMP降解，细胞内cGAMP水平显著提升，进一步激活STING通路的关键蛋白磷酸化及下游IFNB1、CXCL10等基因表达。转录组数据显示，MTX促进I型干扰素通路强烈激活，且此效应依赖ENPP1活性抑制。

叶酸拮抗剂诱导肿瘤细胞DNA损伤激活cGAS-STING信号

MTX、RTD和PTD均能引发肿瘤细胞DNA损伤（γH2A.X上升），胞质双链DNA积累，激活肿瘤细胞cGAS-STING通路，促进炎症基因表达。cGAS/STING缺失及TBK1抑制消除该激活表型，机制明确。特别地，MTX在肿瘤细胞与骨髓来源树突细胞（BMDCs）共培养时，通过肿瘤细胞cGAMP诱导激活免疫细胞STING信号，促进免疫启动。

MTX抑制胞外腺苷生成，阻断肿瘤转移

MTX阻断ENPP1水解cGAMP及ATP生成AMP过程，降低肿瘤微环境腺苷水平，从而抑制通过A2B受体介导的肿瘤细胞迁移。4T1与B16.F10动物实验中，低剂量MTX显著抑制肺转移形成，表现出良好安全性。

MTX增强放疗诱导抗肿瘤免疫反应

在4T1原位乳腺癌模型中，MTX与放疗联合显著抑制肿瘤生长并延长生存率。机制上，MTX放大放疗诱导的cGAMP积累，促进CD3+、CD8+ T细胞和树突状细胞浸润，激活细胞免疫应答。

MTX提升免疫检查点抑制疗效，克服耐药

MC38及4T1肿瘤模型表明，MTX联合抗PD-1抗体显著缩小肿瘤体积、延长生存，且增强CD8+ T细胞效应并减少免疫抑制性调节性T细胞（Tregs）比例。免疫缺陷小鼠及cGAS/STING敲除肿瘤模型显示，MTX抗肿瘤效果依赖于肿瘤细胞cGAS-STING通路及免疫细胞功能。

临床II期试验验证MTX联合免疫及放疗显著疗效

在晚期转移性食管鳞癌患者中，MTX联合PD-1抗体和放疗的客观缓解率达77.1%，显著优于历史数据。治疗组患者外周血干扰素水平升高，肿瘤组织蛋白质组分析显示干扰素相关通路激活。MTX安全性良好，无显著增加传统治疗毒性。

三、研究结论与展望

本研究首次证明甲氨蝶呤在肿瘤微环境中具备“双重免疫激活”功能：一方面通过诱导肿瘤细胞DNA损伤促进cGAMP生成，激活cGAS-STING信号；另一方面抑制肿瘤细胞表面ENPP1催化活性，减缓胞外cGAMP水解，进而增强肿瘤免疫环境中STING通路活性，促进树突状细胞和效应T细胞浸润及功能激活。同时，MTX通过减少腺苷水解产物，抑制肿瘤免疫抑制微环境，阻断肿瘤转移。应用低剂量MTX联合放疗及免疫检查点阻断治疗，显著增强了抗肿瘤效果，并在临床试验中表现出安全性和有效性。

该研究不仅为MTX在肿瘤免疫治疗中开辟了全新用途，也为靶向ENPP1/DNA损伤双通路协同激活STING的新型抗肿瘤药物开发提供了理论依据，具有重大临床转化潜力。

——梅斯编辑点评——

作为一款临床广泛应用的叶酸拮抗剂，甲氨蝶呤以其原有的抗代谢及免疫抑制作用为人所熟知，而本研究利用先进人工智能技术，突破传统思维，发掘其隐藏的免疫激活潜力，具有卓越的创新性和临床价值。MTX通过精准调控cGAS-STING信号通路及腺苷代谢的双重机制，显著改善放疗及免疫治疗效果，为应对肿瘤免疫耐药难题提供新策略。此外，该研究示范了AI在药物再利用及新机制发现中的巨大潜力，具有里程碑意义。后续进一步多中心大样本临床验证及MTX与其他免疫药物的联合策略优化，值得期待。对于临床医生而言，这一研究为低成本、高安全性的免疫调节剂应用提供了科学依据，将直接推动实体瘤综合治疗方案的升级。

——梅斯张博士补充——

值得注意的是，本研究中的MTX采用的是低剂量用法，避免了高剂量时的免疫抑制作用，达到了免疫激活与安全性的理想平衡。此外，鉴于ENPP1在多种实体瘤中的高表达，MTX这一老药新用款式有望广泛应用于不同肿瘤类型。未来对ENPP1表达水平及cGAS-STING状态的精准检测与患者分层筛选，将进一步提升治疗的精准性和个体化。

欢迎广大肿瘤科医生、放疗科专家及免疫学研究者关注此项突破性成果，共同推动肿瘤免疫治疗临床实践的革新升级。

参考文献

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原文链接

Ruirui Yang, Bei Wang et al. Methotrexate exerts antitumor immune activity and improves the clinical efficacy of immunotherapy in patients with solid tumors. Sci. Transl. Med. 2025; 17: eadn6921. DOI:10.1126/scitranslmed.adn6921.

https://www.science.org/doi/10.1126/scitranslmed.adn6921

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