近些年来，「免疫」成为科研的“宠儿”。关于“免疫”的研究历史比较长，但其相关研究在近十年来仍呈爆发式增长，同样是近年来高分文章的焦点之一。在Pubmed数据库中输入“Immunity”，文章数量高达1,604,067篇，2022年的发文量有121,079。

在最新“出炉”的2023年最佳国自然中标研究热点，「免疫」荣登榜首，中标率高达985。对近10年免疫调控项目的中标数进行统计发现，免疫调控中，特别是揭示肿瘤潜在免疫调控机制的，中标数一直趋于上升趋势。

如今，免疫调控的研究已成为医学领域的重要研究方向之一。免疫调控包括凋亡、炎症、自身免疫等多方面；其中，细胞凋亡作为一种十分重要的调节方式，受到了越来越多的关注。而多糖是一种生物反应调节剂，是继手术、放疗和化疗三大治疗手段之后的第四种治疗肿瘤的方法，研究热门程度居高不下。

近日，来自郑大一附院的研究员们在Nature出版集团旗下刊物《Scientific Reports》发表了题为“The anticancer mechanisms of exopolysaccharide from Weissella cibaria D-2 on colorectal cancer via apoptosis induction”的研究论文发现：在癌症免疫治疗中，D-2-EPS多糖激活肿瘤细胞凋亡途径，抑制肿瘤细胞增殖，因而有潜力被开发为预防和治疗结直肠癌的营养保健品或药物。

本文探究了肠道细菌中提取的多糖，其抗肿瘤免疫调控机制，研究方法简单系统易发文，值得学习借鉴！

一、研究背景

结直肠癌（CRC）是全球第三大常见恶性肿瘤，死亡率高，发病率持续增长。但其免疫治疗整体效果并不十分理想，常常伴随着耐药性、器官特异性炎症反应、免疫相关不良事件等严重的副作用。因此，寻找新的、更有效、副作用更少的CRC预防和治疗策略，已成为临床实践中迫切需要解决的重大科学问题。

大量研究表明，肠道微生物与结直肠癌的发生发展密切相关。已有研究报导，某些乳酸杆菌（LAB）、肠球菌和链球菌及其代谢产物在癌症预防和治疗中的起到了重要作用。

乳酸菌胞外多糖（EPS）作为一种由LAB分泌到细胞外环境中的天然多糖（生物聚合物），被普遍认为是安全性较高的（GRAS，美国FDA评价食品添加剂的安全性指标），且被发现具有许多促进健康的生物活性。食窦魏斯氏菌（weissellacibaria）是LAB的一种，同时也是一种肠道菌群，参与肠道微生态的组成。有研究表明，食窦魏斯氏菌具有调节免疫的作用，但会在结直肠癌患者体内减少；然而，食窦魏斯氏菌是否可直接抑制结直肠癌及相关机制尚不清楚。 

二、研究思路方法与结论

1.探究食窦魏斯氏菌（D-2）的EPS纯化和表征

研究方法：

（1）琼脂平板上加入蔗糖，培养食窦魏斯氏菌D-2菌株，观察不同培养基中的菌落表型。

（2）提取并培养食窦魏斯氏菌D-2的EPS，通过扫描电镜（SEM）观察冻干D-2-EPS其微观形貌。

（3）通过苯酚-硫酸法、硫酸-咔唑法和紫外可见分光光度计（UV）检测，验证多糖样品纯度。

（4）通过FT-IR光谱检测D-2-EPS的官能团和键构型，凝胶渗透色谱（GPC）分析其分子量，高效液相色谱法（HPLC）分析D-2-EPS组成。

研究结论：食窦魏斯氏菌D-2通过优化发酵参数，可以生产更多具有多孔网状结构的高纯度D-2-EPS。

2.探究D-2-EPS的抗癌能力（对CRC增殖、细胞周期、迁移和侵袭的影响）

研究方法：

（1）CCK8（细胞计数）检测D-2-EPS对CRC细胞增殖能力的影响，测量D-2-EPS在浓度梯度下对正常肠上皮细胞系NCM460的细胞毒性。

（2）克隆实验验证D-2-EPS对CRC细胞增殖的长期抑制作用。

（3）流式细胞术检测D-2-EPS处理后，G0/G1、G2期和S期CRC细胞比例。

（4）通过划痕实验和Transwell（细胞体外侵袭）实验检测D-2-EPS处理后CRC细胞的迁移侵袭能力。

研究结论：

（1）D-2-EPS抑制CRC细胞的增殖生长，且对正常肠上皮细胞基本无毒。

（2）D-2-EPS通过诱导细胞周期停滞在G0/G1期，对CRC细胞具有抗增殖活性。

（3）D-2-EPS对CRC细胞具有抗迁移和抗侵袭能力。

3.确定D-2-EPS抑制CRC细胞具体机制

研究方法：

（1）AnnexinV-FITC/PI法检测早、晚期凋亡细胞数量。

（2）检测CRC（SW480和HT29细胞）中凋亡相关蛋白（如坏死因子受体（Fas）及其配体（FasL）、人裂解胱天蛋白酶8（CleavedCAS）8、胱天蛋白酶3（caspase-3））的表达。

（3）建立HT29皮下荷瘤模型，瘤内注射不同浓度D-2-EPS，观察肿瘤生长。检测HT29荷瘤小鼠中Ki67（反映肿瘤细胞增殖能力的标志物）的表达，以及凋亡相关蛋白表达。

（4）HE染色分析D-2-EPS对正常小鼠器官（如心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏）的毒性。

研究结论：

（1）D-2-EPS通过Fas/FasL介导的caspase依赖性死亡途径触发HT29细胞凋亡。

（2）D-2-EPS显著抑制HT29荷瘤小鼠的肿瘤生长，且对体重和重要器官没有明显的毒副作用。

三、小结

综上所述，D-2-EPS在体内外均表现出抗结肠癌增殖的作用，且对正常细胞没有明显的毒性。同时，D-2-EPS可能通过激活Fas/FasL-Caspase8-Caspase3通路诱导细胞凋亡来抑制CRC细胞的增殖和活力，通过使CRC细胞的细胞周期停滞在G0/G1期，来抑制迁移和侵袭。因此，鉴于这些发现，D-2-EPS作为预防结直肠癌的潜在营养保健品或药物值得进一步深入研究。

参考来源：

Du Y, Liu L, et al. The anticancer mechanisms of exopolysaccharide from Weissella cibaria D-2 on colorectal cancer via apoptosis induction. Sci Rep. 2023 Nov 30;13(1):21117.

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