血液中的游离DNA (cfDNA) 主要由核小体相关片段组成，这些片段在很大程度上保留了其来源细胞的染色质结构信息，对cfDNA的分析显示出了早期癌症检测的巨大潜力。一些研究已经开发出利用染色质相关特征进行癌症无创检测或监测的方法，包括核小体占用率、WPS（window protection score）和片段谱。但这些方法依赖于全基因组测序（WGS），因此不能提供进一步的表观遗传信息。

此外，cfDNA甲基化已被证明是癌症早期检测的一种生物标志物。传统的基于亚硫酸氢盐的甲基化测序会严重破坏DNA，不适用于分析cfDNA特征。无亚硫酸氢盐DNA甲基化测序方法的发展，如酶促甲基测序（EM-seq）和TET辅助吡啶硼烷测序（TAPS），提高了甲基化测序质量，降低了测序成本。但这两种方法在很大程度上受到小样本量的限制，并且无法利用来自cfDNA的全谱表观遗传学信息。

美国加利福尼亚大学欧文分校医学院Wei Li团队与Helio Genomics公司首席科学官David J. Taggart等人合作，在Genome Medicine上发表了题为“Multimodal epigenetic sequencing analysis (MESA) of cell-free DNA for non-invasive colorectal cancer detection”的文章。为了捕获多种形式的表观遗传信息，研究团队开发了多模态表观遗传测序分析方法MESA，该方法可捕获和整合cfDNA中的各种表观遗传特征。研究显示，MESA能够同时推断4种表观遗传模式：cfDNA甲基化、核小体占有率、核小体模糊性以及跨基因启动子和多聚腺苷酸化位点的WPS。当应用于来自3个结直肠癌临床队列的690个cfDNA样本时，在MESA中引入新的模式（例如核小体模糊性）和基因组特征（例如多聚腺苷酸化位点）显著改善了癌症的检测，超越了传统的甲基化表观遗传标志物检测。

文章发表于Genome Medicine

为了系统地证明MESA的性能，研究人员从三个队列的血液样本中分离cfDNA（队列1和队列2用来展示MESA方法的多功能性和稳健性，队列3分为队列3.1和3.2进行跨队列验证），然后使用三个靶标组合进行处理以生成靶向EM-seq文库。对EM-seq数据的分析可以提取四种模式：cfDNA甲基化、核小体占有率、核小体模糊性和WPS。然后，分别对每种模态进行特征处理和选择（图1）。靶区设计包括甲基化panel和核小体panel，其包括围绕癌症相关基因的转录起始位点（TSS）和多聚腺苷酸化位点（PASs）区域。这一设计不仅适用于结直肠癌，也能够适应其他癌症类型或非癌症疾病。

图1.MESA设计示意图。

01 MESA中的cfDNA甲基化能够准确检测结直肠癌

首先，研究人员探索了MESA中的cfDNA甲基化特征单独区分癌症患者和非癌症对照的有效性。结果显示，与非癌症对照相比，癌症样本中所有靶标CpG位点的平均甲基化水平均升高（图2A和B），与靶向CpG位点主要位于启动子区域的事实一致。所有靶标CpG位点中cfDNA甲基化水平的主成分分析（PCA）显示PC1和PC2中的合理分离（图2C和D）。研究人员利用机器学习方法分析了这些甲基化特征在结直肠癌预测中的性能。结果表明，在MESA中cfDNA甲基化可以用于检测结直肠癌。

图2.MESA中的cfDNA甲基化能够准确检测结直肠癌。

02 MESA成功捕获核小体组织信息

与亚硫酸氢盐测序相比，EM-seq保留了cfDNA的完整性，使研究人员能够捕获额外的表观遗传信息。在所有测序片段中，cfDNA片段长度分布中约166bp（对应于与核小体和连接组蛋白相关的DNA长度）的峰值（图3A），这与cfDNA全基因组测序数据一致。进一步检验支持了cfDNA和核小体之间的联系（图3B），其概括了由微菌核酸酶消化的核小体相关片段的关键特征。

为了准确检测来自cfDNA的核小体组织图谱，研究人员使用了定量方法DANPOS2，结果表明，靶向EM-seq成功捕获了核小体信息。有趣的是，研究人员还观察到多聚腺苷酸化位点周围的核小体缺失区域和位于该区域两侧的定位良好的核小体（图3E）。以上结果表明，MESA成功捕获了TSS和多聚腺苷酸化位点中的核小体组织信息。

图3.MESA成功捕获核小体组织信息。

03 MESA中的核小体占据和模糊性能准确检测结直肠癌

基于DANPOS2可以准确检测靶向EM-seq的核小体组织特征，研究人员探究了这些特征是否可以用于癌症检测：核小体占有率和核小体模糊性。在四个区域显示了队列1中癌症和对照样本之间的占有率或模糊性变化（图4B）。特别是，在TSS和多聚腺苷酸化区域都发现了这些变化，强调了在MESA设计中引入多聚腺苷化位点靶区的重要性。

然后，研究人员分析了核小体占有率和模糊性的预测潜力。仅基于TSS靶区的核小体占有率模型，队列1的AUC为0.8494，队列2的AUC达到0.9213（图4C和D），添加多聚腺苷酸化位点靶区进一步提高了模型性能（图4C和D）。该方法设计的新颖之处是引入了核小体模糊性，反映了染色质水平上的细胞异质性。以上结果表明，在MESA中引入核小体模糊性的模型在癌症检测中表现出良好的性能，多聚腺苷酸化位点的添加进一步提高了模型的性能（图4E和F）。

图4.核小体占有率和模糊性使得MESA能够准确检测癌症。

04 将多模态表观遗传特征整合到MESA中可增强癌症检测

研究人员探究了在MESA中整合多模态表观遗传特征用于癌症检测的能力。除了DNA甲基化、核小体占有和核小体模糊性特征外，WPS也被广泛用于癌症检测。使用leave-one-out交叉验证，研究发现与四个单模态模型相比，综合模型具有最高的AUC、灵敏度（90% 特异性）和F1得分（图5A和B），突出了在癌症预测中纳入多模态信息的益处。当根据癌症分期评估模型时，多模态模型仍然优于单模态模型。此外，研究发现四个单模态模型的模式相似，表明每个模态一致地预测了大多数样本的相同分类（图5D和E）。当检查不同单模态模型的概率之间的相关性时，发现相关性低至0.53（图5G和H），这表明单模态模型可以捕获癌症检测的补充信息。综合模型的性能改善与单一模式集成结合互补信息的事实一致。

图5.在MESA中整合多模式表观遗传特征提高了癌症检测模型的性能。

05 MESA 用于其他不含亚硫酸氢盐的DNA甲基化测序方法

研究人员在另一种无亚硫酸氢盐的cfDNA测序方法cfDNA TAPS上测试了MESA，DANPOS2报告的cfDNA TAPS数据的占有率与淋巴母细胞样细胞的核小体图谱一致（图6A），表明cfDNA TAPS可以像靶向EM-seq一样捕获核小体信息。虽然序列深度较低，研究人员仍然观察到癌症和对照样本在TSS或多聚腺苷酸化位点周围区域的占有变化（图6B）。

然后，研究人员提取了三种类型的特征，包括DNA甲基化、核小体占有和WPS，将队列1和队列2的相同模型训练方法应用于cfDNA TAPS数据队列。结果发现，与三个单模态模型相比，多模态模型具有最高的AUC（图6C和D）。由于该数据集中有两种癌症类型，研究人员还训练了三类模型来区分HCC、PDAC和对照，发现多模态模型的总体精度为0.6892（图6D），优于三个单模态模型。以上结果表明，MESA对多模式表观遗传学特征的综合分析广泛适用于多种非破坏性甲基化测序方案。

图6.cfDNA TAPS的多模态表观遗传分析提高了癌症检测模型的性能。

综上所述，在使用EM-seq或cfDNA TAPS的四个不同队列中，与基于单一模式的模型相比，整合了多种表观遗传学模特征MESA对结直肠癌、肝癌和胰腺癌的检测准确性更高，具有良好的性能和灵活性，且成本相对较低。随着基于cfDNA甲基化的液体活检获得越来越多的关注和临床应用，MESA代表了一个广泛适用的平台，可用于改进非侵入性癌症检测。

论文原文：

Li Y, Xu J, Chen C, et al. Multimodal epigenetic sequencing analysis (MESA) of cell-free DNA for non-invasive colorectal cancer detection. Genome Med. 2024;16(1):9. Published 2024 Jan 16. doi:10.1186/s13073-023-01280-6

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