目前，人们对人类胚胎早期发育的了解仍十分有限，特别是从原肠胚形成到早期器官发生，在此期间主要胚胎细胞类型是动态的。由于与人类密切的进化关系，非人类灵长类动物经常被用作了解人类发育的替代品。

近期已有相关研究发表，来自6个流产人类胚胎和5个CS 12-16和15个CS 3-7食蟹猴胚胎的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据为研究灵长类动物早期发育提供了宝贵的资源。虽然取得了这些进展，但人类和非人类灵长类动物（NHP）胚胎的CS 8-11单细胞转录组仍然无法获得，这严重阻碍了对灵长类动物几种最常见先天性畸形病因的研究。

近日，来自中国科学院动物研究所的研究团队收集了6个CS 8-11期食蟹猴胚胎，对其56,636个单细胞进行了转录组学分析。研究团队对CS 8-CS 11食蟹猴胚胎的综合单细胞转录组图谱研究，不仅弥补了灵长类胚胎发生的知识差距，并扩大了胚胎数据集的收集，有助于比较发育生物学和类器官模型的基准测试。该研究结果发表在Nature上，文章题为“Primate gastrulation and early organogenesis at single-cell resolution”。

研究团队收集了6个食蟹猴胚胎，分别为CS8、CS9和CS11分期（图1）。所有胚胎在形态上都表现正常，具有预期的解剖特征。研究团队将样本分离成单细胞，使用10X Genomics Chromium平台对67,418个细胞进行测序。在过滤掉双联体和低质量细胞后，共保留了56,636个细胞用于后续分析，每个细胞检测到的基因中位数为3,017。基于已知谱系标记的表达，并与相应发育阶段的小鼠胚胎数据集进行比较，确定了38个主要的细胞簇。从CS11胚胎中鉴定出的外胚层细胞（EPI细胞）和多能干细胞（PS细胞，簇号1和2）的代表性非常低，表明在CS11发育阶段原肠胚发育接近完成。

图1.食蟹猴胚胎CS8-11位点的单细胞转录组图谱构建。

为了研究食蟹猴原肠形成和早期器官发育过程中的分子和细胞动力学，研究团队分析了RNA速度（RNA velocity），利用剪接动力学来预测分化轨迹。首先关注PS形成相关的簇，包括PS，前原始条纹（APS）、限定性内胚层（DE）、新生中胚层（Nas）簇。结果显示，与小鼠相似，RNA速度预测了食蟹猴PS/APS向DE、Nas分化的轨迹（图2）。单细胞调控网络推断和聚类（SCENIC）和免疫荧光（IF）分析显示，PS、APS和Nas在聚类中富集了几种转录因子（TF）。

图2.食蟹猴胚胎中PS细胞及其衍生物的发育轨迹。

为深入了解灵长类动物的神经管发育，研究团队重新分析了来自两个食蟹猴CS11胚胎的前脑/中脑/后脑（FB/MB/HB，聚类号为0）和SC（集群号）细胞。发现中脑、后脑边界（midbrain-hindbrain boundary, MHB）来源于MB，以神经管形态收缩为特征，也可以通过PAX8、FGF8和PAX5的上调来识别。同时，研究团队重点研究了WNT通路和HOX家族基因。与FB相比，MB细胞中许多WNT通路相关基因上调，意味着WNT活性增加。许多HOX基因被发现富集在来自主干区域的神经细胞中，表明它们在神经管的A-P模式中起作用。

图3.食蟹猴胚胎神经细胞的发育。

虽然小鼠和食蟹猴是广泛用于研究人类发育的动物模型，但仍缺乏对小鼠、食蟹猴和人类器官发生早期步骤的单细胞转录组比较。为此，研究团队将CS8-11食蟹猴胚胎scRNA-seq数据集与来自相应发育阶段（Theiler stage，TS）小鼠胚胎的单细胞转录组整合在一起。SCMAP分析表明，来自CS8-9和CS11胚胎的细胞大多与TS9-12小鼠胚胎的类似细胞类型相当。UMAP显示两个物种的主要细胞类型非常匹配（图4）。基于这一整合数据集，研究团队进行了跨物种比较，并确定了EPI、PS、APS、原始生殖细胞（PGCs）、外胚层（NE、FB/MB/HB、SE、SC和NC）、中胚层（NODE、Nas）的许多保守和分歧的转录组特征。

图4:早期胚胎器官发生的跨物种转录组比较。

研究团队通过对56,636个细胞的综合scRNA-seq分析，确定了38个主要的细胞簇，并揭示了灵长类动物在原肠胚形成和早期器官发生过程中存在的所有三个主要胚层的发育景观。通过比较CS8-11食蟹猴胚胎的单细胞转录组与处于相似发育阶段的小鼠胚胎，深入了解了物种间保守和不同的转录组特征。该研究揭示了主要的泌乳周细胞类型的转录组特征，有助于阐明灵长类动物的形态发生事件。

参考资料：

Zhai, J., Guo, J., Wan, H. et al. Primate gastrulation and early organogenesis at single-cell resolution. Nature 612, 732–738 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05526-y

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Tags： Nature | 单细胞分辨率绘制食蟹猴胚胎综合转录组图谱，揭示原肠胚形成和早期器官发生