在对抗癌症的战役中，如何将药物精准、高效、安全地送达肿瘤组织，同时最大程度减少对正常组织的伤害（即“脱靶毒性”），一直是科学家们孜孜以求的目标。蛋白质，作为生命的基本元件，以其优异的生物相容性、可基因编程性以及结构均一性，成为构建新一代药物递送系统的理想“材料”。然而，精确控制蛋白质纳米颗粒的组装结构，并建立其宏观性质（如大小、药物释放速度）与微观分子设计之间的关联，仍是巨大挑战。

近日，内蒙古大学李昕宇团队在《Journal of Controlled Release》上发表题为 “Chimeric Collagen-like Proteins with Tunable Structural Heterogeneity for Precise Control and Targeted Doxorubicin Delivery”的重要研究成果。他们受细菌嵌合胶原样蛋白（CLP）启发，创新性地设计并构建了一系列结构高度可编程的嵌合胶原样蛋白（Chimeric CLP-like Proteins）。这些蛋白作为“智能骨架”，成功负载阿霉素，形成嵌合胶原样蛋白-阿霉素偶联纳米复合物（CDCNs），并在三阴性乳腺癌（TNBC）和胶质母细胞瘤（GBM）两种恶性实体瘤模型中，展现出卓越的靶向递送能力、增强的抗肿瘤效果和显著降低的系统毒性。

图1：CDCNs的设计与制备机制。 (A) DOX活化示意图。(B) 嵌合蛋白结构域组成：N端刚性球状结构域、柔性线性胶原样结构域、C端DOX偶联位点。(C) 活化的DOX通过迈克尔加成反应与蛋白载体上的半胱氨酸残基偶联。(D) CDCNs的宏观结构模型：DOX偶联的线性域被包裹在核心，刚性球状域形成纳米粒外壳。（来源：论文Fig 1）

创新设计：模块化构建，精准调控

研究团队的核心突破在于其模块化设计策略。他们设计的嵌合蛋白包含三个关键域（图1B）：

N端刚性球状结构域（如α-螺旋或β-折叠）：提供稳定性和作为后续靶向肽的融合位点。

中部柔性线性胶原样结构域（(Gly-Xaa-Yaa)n重复序列）：决定纳米粒大小和药物释放速率的关键。

C端特异性偶联位点（(GC)n序列）：用于通过稳定的硫醚键共价偶联经活化的DOX。

通过基因工程技术，研究人员可以精确调控这三个结构域的长度、类型（α-螺旋， β-折叠）和数量（如偶联位点数）。这种结构上的“可编程性”，使得CDCNs的宏观性质（粒径、形貌、载药量、释放动力学）能够被精准定制。

图2：线性结构域长度对CDCNs的影响。 (A) 不同长度线性结构域CLPs的设计及预测结构（红色：线性域；蓝色：α-螺旋域；紫色：DOX偶联位点）。(B) V_α222CLP3-DOX CDCNs的TEM图像（均匀球形）。(C) 线性域长度对CDCNs粒径的影响（DLS分析）。(D) 线性域长度对DOX包封率的影响。(E) 不同pH下，线性域长度对DOX释放动力学的影响。（来源：论文Fig 2）

关键发现：结构决定性能

研究揭示了嵌合蛋白的微观结构如何决定CDCNs的宏观性能和药效：

1、线性域长度 (图 2):

长度↑ → 粒径↓，包封率↑：更长的亲水线性序列促进疏水DOX分子聚集，形成更致密的内部结构。

长度↑ → 释放速率↑：更长的亲水柔性链在生理环境中促进纳米粒溶胀，增强基质渗透性，加速药物扩散（尽管核心更密，但溶胀效应占主导）。

2、刚性结构域类型与长度 (图 3):

α-螺旋域长度↑ → 外壳厚度↑ → 释放速率↓：更长的刚性α-螺旋形成更厚更致密的外壳，减缓药物扩散（屏障效应）。(Fig 3A-G)

β-折叠域长度↑ → 包封率↓ → 释放速率↑：β-折叠的刚性和平面构象增加了蛋白质载体的疏水性，减少了与疏水药物DOX的结合，同时降低了药物扩散的内部阻力。(Fig 3H，N) 

图3：N端球状结构域异质性对CDCNs的影响。 (A, D) N端α-螺旋异质性设计及蛋白预测结构（蓝色：线性域；红色：α-螺旋域；紫色：偶联位点）。(B, C) TEM图像及统计分析显示α-螺旋长度增加导致外壳增厚。(E) α-螺旋长度增加导致粒径略增。(F) α-螺旋复杂度增加显著减缓DOX释放。(G) α-螺旋异质性对包封率影响小。(H, J) N端β-折叠异质性设计及蛋白预测结构（蓝色：线性域；红色：β-折叠域；紫色：偶联位点）。(I) β-折叠异质性对CDCNs宏观结构影响小。(K) β-折叠异质性对Zeta电位影响小。(L) β-折叠复杂度增加使粒径略降。(M) β-折叠复杂度增加显著加速DOX释放。(N) β-折叠结构增加显著降低包封率。（来源：论文Fig 3）

3、DOX偶联位点数量 (图4):

位点数↑ → 粒径↓，包封率↑：更多结合位点提高了载药量，形成更致密的CDCNs结构。位点数↑ → 释放速率↓：更高的载药量导致疏水DOX分子聚集形成更致密的疏水核心，使CDCNs更均质稳定，减缓释放。

图4：DOX偶联位点数量对CDCNs宏观结构和药物包封的影响。 (A) 具有不同DOX偶联位点数量（1, 3, 5）的CLPs构建示意图。(B) TEM图像显示偶联位点增多（V_α222CLP3GC5-DOX vs V_α222CLP3GC1-DOX）导致粒径显著减小。(C) DLS分析证实粒径随偶联位点增加而减小。(D) 包封率随偶联位点增加而提高。(E) 更多偶联位点减缓了不同pH下的DOX释放速率。（来源：论文Fig 4）

精准打击：靶向治疗三阴性乳腺癌（TNBC）

当使用上述10种CDCNs对HeLa细胞进行孵育，我们注意到V_α222CLP3GC-DOX杀伤率最强，高达66.4%。基于上述研究，团队筛选出综合性能最优的载体V_α222CLP3GC5（尺寸合适、载药量高、释放速率适中，对癌细胞致死率最高）。为了赋予其靶向能力，他们将尿激酶型纤溶酶原激活物（UPA）肽基因融合到该载体的N端（图5A）。UPA肽能特异性识别在TNBC细胞（如4T1细胞）上高表达的uPAR受体。

1、精准识别：荧光显微镜显示，UPA修饰的CDCNs (UPA-CDCNs) 能高效被uPAR阳性的4T1 TNBC细胞内吞，而在uPAR阴性的HeLa细胞中则主要滞留在细胞膜上（图5D）。

2、强力杀伤：在体外，UPA-CDCNs对4T1细胞展现出强大的杀伤力，诱导显著凋亡（图5C）。机制研究表明，其通过上调P53、Caspase-3、Cleaved Caspase-3，下调BCL-2，激活了经典的DOX凋亡通路（图5E）。

3、安全性高：溶血实验证明UPA-CDCNs具有良好的生物相容性（图5F）。

 

图5. TNBC靶向CDCNs的体外抗肿瘤效果。(A) TNBC靶向肽UPA融合至V_α222CLP3GC5 N端构建UPA-CDCNs示意图。(B) 流式细胞术分析显示不同CDCNs的抗肿瘤效果，V_α222CLP3GC5-DOX抑制效果最佳。(C) 活/死染色图像评估UPA-CDCNs抗肿瘤效果。(D) UPA-CDCNs靶向能力成像（红色DOX荧光）：在uPAR+ 4T1细胞内强积累，在uPAR- HeLa细胞外滞留。(E) Western blot分析显示UPA-CDCNs处理上调促凋亡蛋白(P53, Caspase-3, Cleaved Caspase-3)，下调抗凋亡蛋白(BCL-2)。(F) 溶血实验证实UPA-CDCNs生物相容性良好。（来源：论文Fig 5）

体内显神威：高效抑瘤，毒性大降

在TNBC原位小鼠模型中的评价更令人振奋（图6）：

精准富集，长效滞留：静脉注射Cy7标记的纳米颗粒后，荧光成像显示，UPA-CDCNs能长时间富集在肿瘤部位（荧光持续24小时），而未修饰的CDCNs在16小时内就被快速清除（图6D）。离体器官成像进一步证实UPA-CDCNs在肿瘤部位有强荧光信号，而CDCNs主要富集在心脏和肾脏（图6G）。

TNBC模型 (UPA-CDCNs):

1、强效抑瘤： 显著抑制肿瘤生长（肿瘤体积/重量远低于PBS和游离DOX组）（图6E, F），延长生存期（中位>40天 vs PBS组18天，DOX组28天）（图6C）。

2、精准靶向： 体内成像显示UPA-CDCNs在肿瘤部位长时间滞留富集（图6D, G），而普通CDCNs被快速清除。

3、促进凋亡： 肿瘤组织内广泛凋亡，促凋亡蛋白表达上调（图6H, I, J, K）。

 

图6. UPA-CDCNs的体内抗TNBC效果。(A) 实验设计时间线。(B) 生物发光成像及相对强度定量显示UPA-CDCNs显著抑制肿瘤进展。(C) 荷瘤小鼠生存曲线（UPA-CDCNs组显著延长）。(D) 活体荧光成像评估CDCNs和UPA-CDCNs药代动力学（UPA-CDCNs肿瘤滞留时间长）。(E, F) 解剖后代表性肿瘤图像、肿瘤重量和直径记录（UPA-CDCNs组最小）。(G) 主要器官荧光成像显示UPA-CDCNs肿瘤特异性富集（与C图对应）。(H) 肿瘤组织H&E染色（中央区），红箭头示凋亡区域。(I) 全肿瘤组织蛋白表达Western blot分析。(J) 肿瘤组织BCL-2免疫组化（红虚线示凋亡区、实体瘤、过渡区）。(K) 肿瘤组织Caspase 3 / Cleaved Caspase 3免疫荧光。（来源：论文Fig 6）

安全性优势（图7）：

1、心脏保护： 游离DOX引起明显心肌病变（心脏组织切片可见深色点状病灶，图7E），而UPA-CDCNs未观察到心脏毒性或主要器官损伤。

2、降低系统毒性： UPA-CDCNs治疗组血清中心肌损伤标志物（CK, LDH-L）、肝损伤标志物（ALT, AST）水平显著低于游离DOX组，接近正常水平（图7B, C, D, F, G）。无溶血反应（图5F）。

图7. UPA-CDCNs相比游离DOX生物毒性降低。(A) TNBC小鼠不同治疗组各组织照片（DOX组脾肿大）。(B) 血清碱性磷酸酶（ALP）水平（脾肿大相关，UPA-CDCNs组略降）。(C, D) 血清丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平（肝损伤标志，UPA-CDCNs组接近正常）。(E) 心、肝、脾、肾组织H&E染色。红虚线和黑箭头强调游离DOX诱导的心肌病（心脏切片深色点状物质）。(F, G) 血清肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH-L）水平（心肌损伤标志，DOX组显著升高）。（来源：论文Fig 7）

突破血脑屏障：靶向治疗致命脑瘤（胶质母细胞瘤, GBM）

团队进一步探索了该平台用于治疗致命脑瘤GBM的潜力。他们将GBM靶向肽LinTT1基因融合到V_α222CLP3GC5的N端。LinTT1能特异性结合GBM微环境中肿瘤和基质细胞表面异常表达的线粒体蛋白p32。

1、体外高效杀伤GBM细胞：

LinTT1-CDCNs 处理 GBM 细胞 (GL261) 12 小时，即可导致 64.3% 的细胞死亡，效果显著优于游离阿霉素（DOX，仅 19.8%）。

2、作用机制： 通过激活 P53-Caspase 凋亡通路 诱导细胞死亡。

突破血脑屏障（BBB）：

3、体外模型： LinTT1-CDCNs 能有效穿越 Transwell BBB 模型。

 体内模型（小鼠）： 静脉注射后 24 小时，能在大脑中检测到明显的 Cy7 荧光信号，证明其成功穿越 BBB 到达脑部肿瘤部位（图8B, C）。

对比： 未修饰的 CDCNs 主要聚集在心脏和肾脏，无法有效进入大脑（图8B, C）。

体内高效抗肿瘤，显著延长生存期：

肿瘤抑制： LinTT1-CDCNs 治疗组使肿瘤生物发光信号降低 50%，DOX 组降低 20%，PBS 组增加 20%（图8D, E）。

生存期： 显著延长小鼠中位生存期至 40 天以上，PBS组18天，DOX组26天（图8F）。

组织学证据：H&E 染色显示 LinTT1-CDCNs 组 GBM 病灶显著缩小。Western Blot、免疫组化、免疫荧光证实 LinTT1-CDCNs 处理显著：上调促凋亡蛋白：P53, Caspase-3, Cleaved Caspase-3, TNF-α, CD63（图8G, H, I）。下调抗凋亡蛋白：BCL-2（图8G）。

图8. LinTT1修饰CDCNs的抗GBM效果。(A) 体内抗GBM实验时间线。(B) 活体荧光成像示踪Cy7标记的CDCNs和LinTT1-CDCNs药代动力学。(C) 给药24小时后主要器官荧光成像显示LinTT1-CDCNs成功穿越BBB在脑部富集，而CDCNs主要富集于心肾。(D) GBM模型小鼠生物发光成像。(E) 不同治疗后GBM相对生物发光强度定量（LinTT1-CDCNs组显著降低）。(F) 生存曲线（LinTT1-CDCNs组生存期显著延长）。(G) 全脑组织凋亡相关蛋白Western blot分析。(H) 脑组织H&E染色显示LinTT1-CDCNs治疗显著减小GBM病灶。(I, J) GBM病灶处BCL-2免疫组化及Caspase-3/ Cleaved Caspase-3免疫荧光。（来源：论文Fig 8）

意义与展望：开启蛋白药物递送新篇章

该研究不仅成功开发了针对TNBC和GBM的高效低毒靶向递送系统，其提出的“结构可编程嵌合胶原样蛋白”设计策略具有更深远的意义：

1、精准调控： 通过调整蛋白微观结构（线性域长、刚性域类型/长度、偶联位点数），可精确控制纳米粒的宏观性质（粒径80-800 nm可调，释放时间20-40 h可调），满足不同肿瘤治疗需求。

2、模块化平台： N端可作为“通用接口”融合多种靶向肽（如UPA, LinTT1）、免疫调节肽、甚至光动力/光热响应肽，轻松构建多功能治疗载体。

3、拓展性强： 该平台可整合刺激响应元件（如MMP酶切位点、光敏蛋白），实现药物在肿瘤部位的智能响应释放。其应用前景不限于癌症治疗，还可拓展至免疫佐剂、抗生素递送等领域。

4、安全优势： 基因工程设计的de novo CLP作为“空白模板”，减少了暴露的功能基团，相较于天然蛋白（如BSA, HSA），潜在免疫原性风险更低，且具备高纯度、批次间一致性好、易于规模化生产等优势。

结论：

内蒙古大学李昕宇团队开发的基于嵌合胶原样蛋白的CDCNs平台，巧妙地结合了刚性球状蛋白的稳定性和线性胶原蛋白的可调性，通过基因工程实现了载体结构-性能-功能的精准编程。该平台在TNBC和GBM模型中展现出的高效靶向、强效抑瘤和卓越安全性，为克服传统化疗药物的毒副作用和递送瓶颈提供了强有力的新工具。其模块化、可编程的设计理念，为下一代智能化、多功能蛋白基药物递送系统的开发开辟了广阔道路。

参考文献：

Xia, Y., Li, Y., Huang, J., et al. (2025). Chimeric collagen-like proteins with tunable structural heterogeneity for precise control and targeted doxorubicin delivery. Journal of Controlled Release , 386 ( 2025 ), 114131.

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2025.114131

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