引言

8月5日，《Cell》的研究报道“AI-generated MLH1 small binder improves prime editing efficiency”，为基因编辑领域带来了一项令人振奋的突破。研究人员利用人工智能（Artificial Intelligence, AI）设计出一种微型蛋白“封条”，能暂时“锁住”细胞内一个关键的DNA修复系统，从而将“先导编辑”（Prime Editing, PE）的精准基因编辑技术的效率提升了高达18.8倍。这不仅为基因治疗提供了更强大的工具，也揭示了AI在生命科学领域设计全新功能分子的巨大潜力。

先导编辑，作为CRISPR基因编辑技术的后起之秀，常被誉为“基因魔剪”。与它的前辈们相比，它更像一位精通“查找和替换”的文字编辑，能够在不完全切断DNA双链的情况下，实现对基因序列的精准修改，无论是单个碱基的替换，还是小片段的插入或删除，它都能游刃有余。这种高精准、低脱靶的特性，使其在治疗遗传病方面展现出巨大的应用前景。然而，这位技艺高超的“编辑”却面临着一个尴尬的困境：细胞里住着一位极其敬业的“校对员”——DNA错配修复系统（Mismatch Repair, MMR），它时常会将先导编辑精心完成的“修改稿”当作错误，毫不留情地“纠正”回原来的样子。这使得先导编辑的最终效率大打折扣，限制了其在临床应用中的步伐。

基因编辑的“橡皮擦”困境

如果你正在修改一份重要合同，你将其中一个错误的词语替换成了正确的词语。但软件的自动校对功能却认为你的修改是错误的，并顽固地一次又一次将其恢复到修改前的状态。这正是先导编辑在细胞内遇到的麻烦。

细胞为了维持基因组的稳定，进化出了一套复杂的DNA修复系统，其中错配修复（MMR）系统就是专门负责纠正DNA复制过程中出现的碱基错配的“校对专家”。当先导编辑系统将一段新的DNA序列“粘贴”到基因组上时，会形成一个短暂的、新旧链不完全匹配的区域。MMR系统会敏锐地察觉到这个“不和谐”的结构，并迅速启动修复程序。其中，一个名为MutLα的蛋白复合物扮演了核心角色，它由MLH1和PMS2两种蛋白组成，像一把剪刀，会切除新编辑的DNA链，然后以未编辑的链为模板进行修复，最终导致编辑失败。

为了绕开这个“校对员”，研究人员想出了一个巧妙的策略：引入一个“冒牌”的MLH1蛋白，即显性负相MLH1（MLH1dn）。这个“冒牌货”虽然也能和PMS2结合，但它自身存在缺陷，无法正常工作，从而像一颗卡在齿轮里的石子，让整个MMR修复机器陷入瘫痪。这个方法确实有效，能显著提升先导编辑的效率。但它有一个致命的缺点——太大了。

MLH1dn蛋白由753个氨基酸组成，是一个不折不扣的“大块头”。在基因治疗中，我们通常需要借助一些“快递车”，比如腺相关病毒（adeno-associated viruses, AAVs），将基因编辑工具递送到目标细胞中。然而，这些“快递车”的载货空间非常有限。庞大的MLH1dn往往会“超载”，难以被有效包装和递送，这极大地限制了其在活体治疗中的应用。有没有可能创造一个既能有效抑制MMR，又足够小巧的工具呢？

AI出马，打造“迷你封条”

面对这个挑战，研究人员将目光投向了近年来飞速发展的人工智能。他们设想，是否能利用AI的创造力，从零开始设计一种全新的、微小的蛋白质，它能像一个“迷你封条”一样，精准地贴在MLH1蛋白的关键位置，阻止它与PMS2形成功能性的MutLα复合物？

为了实现这个目标，他们部署了两大AI利器：

首先是RFdiffusion，一个生成式AI模型。可以把它想象成一位极富创造力的蛋白质“艺术家”，它能根据研究人员设定的要求，凭空设计出具有特定结构和功能的全新蛋白质。研究人员给它的任务是：设计一个能够结合MLH1蛋白C端（MLH1-C）的小分子蛋白结合物（MLH1 small binder, MLH1-SB）。

更进一步，研究人员采用了一种极为巧妙的“多点打击”策略。他们不满足于仅仅阻断MLH1和PMS2的结合，而是希望从多个维度彻底“废掉”MutLα的功能。他们在MLH1蛋白上精心挑选了三个“热点区域”作为攻击靶点：

1. “主结合位点”（main binding site）：直接位于MLH1与PMS2的结合界面上，通过空间位阻效应，阻止两者“握手”。
2. “关键活性位点”（critical activity site）：位于MutLα复合物发挥切割活性的区域，目的是破坏其“剪刀”的功能。
3. “额外结合位点”（additional binding site）：作为一种“锚点”，能让这个迷你封条更牢固地附着在MLH1上，从而提高其在靶点附近的局部浓度，增强抑制效果。

这种设计思路，就如同打造一把拥有多重齿牙的特制钥匙，需要精准地插入并转动，才能彻底锁死一个复杂的锁芯。相比于只针对单一靶点的传统方法，这种多管齐下的策略无疑更有可能获得强大的抑制效果。

虚拟“擂台赛”：从千军万马中挑选最强王者

AI“艺术家”RFdiffusion不负众望，挥洒创意，一口气生成了数千个候选的“迷你封条”蛋白。其中，针对两个靶点（主结合位点+关键活性位点）的设计被称为“MC”结合物，共1978个；而针对全部三个靶点的“豪华版”设计被称为“MCA”结合物，共821个。面对如此众多的候选者，如果逐一进行实验室测试，将是一项耗时耗力的艰巨任务。

如何高效地从“千军万马”中筛选出真正的“王者”？研究人员再次请出AI，这次登场的是大名鼎鼎的AlphaFold 3，一个能够极其精准地预测蛋白质复合物结构的AI模型。他们设计了一场别开生面的虚拟“擂台赛”——AlphaFold 3竞争测试。

比赛规则如下：在虚拟空间中，将MLH1和它的搭档PMS2放在一起，同时引入一个AI设计的候选“迷你封条”。然后，让AlphaFold 3预测这三者会如何相互作用，并形成一个什么样的三元复合物结构。评判胜负的关键指标是：在引入“迷你封条”后，MLH1和PMS2之间的距离。如果一个“封条”足够强大，它就会强势插入两者之间，将它们推开，导致它们之间的距离显著增加。反之，如果它是一个“软脚虾”，则无法撼动MLH1和PMS2的紧密结合，两者之间的距离将保持不变。

研究人员设定了一个距离阈值（9.7724 Å），只有那些能将MLH1和PMS2推开到超过这个距离的候选者，才能算作在“擂台赛”中获胜。

研究人员发现，那些为三个靶点设计的MCA结合物，在“擂台赛”中表现出了远超MC结合物的破坏力。这一预测在后续的湿实验中得到了完美的验证。在通过了虚拟筛选的候选者中，研究人员挑选了23个MCA结合物和20个MC结合物进行真实世界的测试。结果显示，高达39%的MCA结合物（23个中的9个）成功地将先导编辑效率提升了3倍以上；而MC结合物的成功率仅为5%（20个中的1个）。更具说服力的是，那些在虚拟“擂台赛”中被淘汰的17个“落败的MCA”候选者，在真实实验中无一例外地全部失败。这充分证明了AI竞争测试强大的预测能力。

小个子有大能量：82个氨基酸的惊人力量

经过层层筛选，一个名为MCA-23的“迷你封条”脱颖而出，成为了该研究的“主角”（为方便起见，我们称之为MLH1-SB）。它的体型小巧到令人惊叹，仅由82个氨基酸组成，其大小不到传统抑制剂MLH1dn的九分之一。这个“小个子”是否真的蕴含着巨大的能量呢？

实验数据给出了肯定的答案。在人HeLa细胞中，当与初代先导编辑系统PEmax共同作用时，MLH1-SB将编辑效率提升了18.9倍。作为对比，传统的“大块头”MLH1dn只能带来7.1倍的提升。这意味着，MLH1-SB的效力是MLH1dn的2.7倍，真正实现了“小而强大”。

更重要的是，MLH1-SB的“小巧”身材使其具备极佳的兼容性。研究人员轻松地将其与更先进的PE7编辑系统整合在一起，构建了一体化的“超级编辑工具”——PE7-SB2。在这个新系统中，两个MLH1-SB分子像“助推器”一样被连接到PE7编辑器的两端。在处理小于12个碱基的编辑时，PE7-SB2的效率比PE7系统本身高出2.5倍，比最初的PEmax系统更是高出惊人的18.8倍。

为了确认MLH1-SB的作用机制确实是通过抑制MMR通路，研究人员进行了一项关键的对照实验。他们在一种天然缺失MLH1蛋白的人HEK293T细胞中测试了MLH1-SB的效果。结果发现，无论是MLH1-SB还是MLH1dn，都无法在这类细胞中提升先导编辑的效率。这清晰地表明，MLH1-SB的“魔力”完全依赖于MLH1的存在，它的确是通过精准“锁住”MMR系统来发挥作用的。

安全第一：AI“封条”会“误伤”吗？

任何试图干预细胞核心生命过程的技术，都必须将安全性放在首位。暂时关闭一个重要的DNA修复通路，听起来像是一件有风险的事情。它会不会导致基因组其他地方的突变率飙升，造成“误伤”呢？研究人员通过一系列严谨的实验，对MLH1-SB的安全性进行了全面评估。

首先是细胞毒性评估。结果显示，表达MLH1-SB或整合了该分子的PE7-SB2系统的细胞，其增殖能力（通过Ki67染色衡量）与对照组相比没有显著差异，细胞死亡率也处于正常水平。这说明，这个AI设计的“迷你封条”对细胞是友好的。

其次是全转录组分析。通过分析细胞内所有基因的表达变化，研究人员发现，MLH1-SB引起的基因表达谱变动，与传统抑制剂MLH1dn非常相似，这表明它们的作用机制高度一致，没有引发意料之外的、广泛的细胞应激反应。

最关键的是全基因组突变分析。研究人员对接受了PE7-SB2系统处理的细胞进行了高深度的全基因组测序（WGS），并与未处理的细胞进行比较。结果令人安心：在整个基因组范围内，无论是单碱基突变还是小片段的插入缺失，处理组与对照组之间都没有显著差异。这为MLH1-SB的安全性提供了强有力的证据，表明这种短暂、可控的MMR抑制策略，并不会在基因组中引发一场“突变风暴”。

此外，他们还检测了先导编辑器本身可能造成的脱靶效应。结果显示，PE7-SB2系统的脱靶率与PE7系统本身相当，说明MLH1-SB的加入并不会增加基因编辑的“误中率”。

从细胞到活体：小鼠实验验证“疗效”

在细胞层面取得的成功固然可喜，但真正的考验在于它能否在复杂的生命体中发挥作用。为此，研究人员将目光投向了小鼠模型。他们通过“尾静脉水动力注射”的技术，将编码PE7和PE7-SB2系统的质粒DNA直接递送到小鼠的肝脏细胞中。

实验结果再次验证了PE7-SB2的强大。在小鼠肝脏中，PE7-SB2系统在Igf2基因上实现的编辑效率是PE7系统的3.4倍，成功地将细胞实验中的优势转化为了活体中的“疗效”。在安全性方面，接受PE7-SB2治疗的小鼠，其肝功能指标（血清中的AST和ALT水平）与接受PE7治疗的小鼠相比没有显著差异，这进一步证实了MLH1-SB在活体内也具有良好的安全性。

值得一提的是，这个为人类MLH1蛋白设计的“迷你封条”，在小鼠身上同样有效。这得益于人类和小鼠的MLH1蛋白具有高达93.2%的序列同源性，显示出该工具具有跨物种应用的潜力。

AI赋能，开启新篇章

这项发表于《细胞》的研究，不仅仅是为基因编辑工具箱增添了一件利器，它更让我们窥见了AI赋能生命科学研究的壮丽未来。

研究人员利用生成式AI，从无到有地创造了一种全新的、小巧、高效且安全的蛋白质抑制剂，解决了长期困扰先导编辑技术的“效率瓶颈”。这种通过AI设计来干预蛋白质相互作用的范式，为新药研发和功能分子设计开辟了一条全新的道路。今天我们能为MMR系统设计“封条”，明天或许就能为癌症相关的信号通路、病毒入侵所需的蛋白复合物设计出更巧妙的抑制剂。

尤其令人兴奋的是，这项研究所依赖的方法论——“多点打击”策略与AlphaFold 3竞争测试的结合，是一套具有普适性的强大工具。它将复杂的蛋白质功能抑制问题，转化为一个可以通过计算来高效解决的结构设计问题。而且，整个设计和筛选过程在短短几天内即可完成，且主要依赖于公开可用的网页版AI工具，这大大降低了技术门槛，使得更多研究者能够利用AI的力量去探索和改造生命。

从虚拟的设计到细胞中的验证，再到活体内的成功应用，这项研究完整地展示了AI如何驱动生命科学发现。它告诉我们，一个由AI深度参与的生物医药新时代已经到来。未来，我们或许能够像编写计算机程序一样，通过AI设计出各种各样的蛋白质“模块”，去精准地调控细胞内的生命活动，为攻克遗传病、癌症等人类顽疾带来前所未有的希望。

参考文献

Park JC, Uhm H, Kim YW, Oh YE, Lee JH, Yang J, Kim K, Bae S. AI-generated MLH1 small binder improves prime editing efficiency. Cell. 2025 Aug 1:S0092-8674(25)00799-8. doi: 10.1016/j.cell.2025.07.010. Epub ahead of print. PMID: 40769155.

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