中风是全球成年人残疾的主要原因之一，每年有大量患者因此遭受长期的神经功能障碍。中风后的脑组织修复和功能恢复是一个复杂的过程，其中新血管形成（neovascularization）在脑损伤后的修复过程中起着关键作用。然而，中性粒细胞的过度浸润会阻碍有效的血管重塑，因此需要及时清除脑内的中性粒细胞以促进中风后的恢复。

人参是中医临床中常用的中药之一，具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血、安神益智的功效。人参皂苷Rg1（Ginsenoside Rg1，Rg1）是人参的主要活性成分之一，具有抗氧化、调节能量代谢和神经保护等作用。然而，由于血脑屏障（BBB）的存在，Rg1在脑组织中的浓度较低，限制了其在中风治疗中的应用。因此，如何提高Rg1在脑内的浓度成为研究的关键。

近期，一项研究开发了一种基于中性粒细胞样细胞膜囊泡（neutrophil-like cell membrane vesicles，NCM）的靶向递送系统，将人参皂苷Rg1负载到NCM中，制备出Rg1@NCM。这种系统利用中性粒细胞膜的天然靶向能力，将人参皂苷Rg1精确递送至脑损伤部位，从而实现治疗效果。

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Rg1@NCM的表征

Rg1@NCM是通过将Rg1负载到从分化后的HL-60细胞制备的NCM中而得到的。研究显示，Rg1@NCM的平均粒径为143.2纳米，具有良好的纳米尺寸，有助于穿透血脑屏障。透射电子显微镜（TEM）观察到Rg1@NCM呈现出规则的球形结构，大小约为140纳米。此外，Rg1@NCM的包封效率达到32.6%，表明Rg1可以有效地被包载到NCM中。在20%胎牛血清（FBS）溶液中，Rg1@NCM在24小时内释放了88%的Rg1，显示出良好的药物释放特性。

同时，Rg1@NCM在48小时内粒径变化不大，表明其在生理条件下具有较好的稳定性。WB实验分析证实了NCM中富含中性粒细胞膜蛋白PSGL-1和integrin β2，这些蛋白在中性粒细胞与炎症内皮细胞的结合中起关键作用，从而增强了NCM的炎症靶向性。

图2 Rg1@NCM的表征

NCM针对中风受伤区域

研究使用光栓塞性中风（PT）小鼠模型评估了NCM对炎症脑的靶向性。将NCM用远红色荧光脂质染料DiD标记后，通过尾静脉注射到PT术后2小时的小鼠体内。1小时后，使用活体成像系统（IVIS）对小鼠的脑和其他器官进行成像，并测量组织匀浆中的DiD荧光强度。结果显示，与未受伤的左脑相比，受伤的右脑中NCM@DiD的积累显著更高。进一步通过高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）分析发现，与注射游离Rg1的小鼠相比，注射Rg1@NCM的小鼠在受伤的右脑半球中的Rg1浓度高出8倍，表明NCM具有良好的炎症靶向性，能够有效帮助Rg1穿过BBB，增加脑内的Rg1含量。

为了进一步观察NCM与脑内细胞的相互作用，研究还使用多光子显微镜对大脑血管中的NCM进行了活体成像。结果显示，Dil标记的NCM在再灌注后2小时逐渐积累并结合到缺血周边区域的血管壁上。在PT小鼠中，Dil标记的NCM在注射后1小时被观察到积累在PT梗死的周边区域，并与内皮细胞（CD31+）结合。在注射后3小时，脑切片的免疫荧光染色显示，约82%的NCM与小胶质细胞（Iba1+）共定位，表明Rg1@NCM可以到达脑损伤部位，并被小胶质细胞摄取。

图3 NCM 针对中风受伤区域

Rg1@NCM减轻了PT小鼠的脑组织损伤并增强了长期功能恢复

研究进一步探讨了Rg1@NCM对PT小鼠脑损伤和功能恢复的影响。PT术后2小时，通过尾静脉注射PBS、NCM、游离Rg1（10 mg/kg）或等剂量的Rg1@NCM。术后3天和28天分别进行结构磁共振成像（MRI）扫描。结果显示，Rg1@NCM组在术后3天的梗死率为6.00%，显著低于PT组的11.04%。而在术后28天，Rg1@NCM组的梗死率仅为0.30%，明显低于PT、游离Rg1和空NCM组（约20-26%）。这表明Rg1@NCM治疗比其他组具有更显著的中风后修复效果。

行为学测试结果显示，与PT组相比，Rg1@NCM治疗组在网格行走测试和圆柱测试中的表现更好，左前肢失误率显著降低，偏差更小。这些结果表明，Rg1@NCM显著减少了脑梗死体积，并增强了小鼠的长期运动功能恢复，且在同等剂量下比游离Rg1更有效。这表明NCM纳米载体有效增强了Rg1的治疗潜力。

图4 Rg1@NCM减轻了 PT 小鼠的脑组织损伤并增强了长期功能恢复

Rg1@NCM改善了PT小鼠的长期脑功能连接

为了评估Rg1@NCM对中风后大脑功能连接恢复的影响，研究在中风后28天对小鼠进行了功能磁共振成像（fMRI）扫描，并分析了不同脑区的低频波动振幅（ALFF）和区域齐次性（ReHo）。与NCM组相比，Rg1@NCM组在多个脑区显示出更高的ALFF值，包括初级运动皮层（MOp）、次级运动皮层（MOs）、初级体感皮层（SSp）、胼胝体（ccb）、扣带回束（cing）和上丘（SC）。ReHo分析显示，Rg1@NCM组在嗅觉区、运动皮层MO、补充体感皮层（SSs）、ccb、cing、小脑和海马等区域的ReHo值更高。

研究还选择了与中风恢复相关的感兴趣区域（ROIs），包括运动皮层、体感皮层和丘脑，以量化这些脑区之间的功能连接强度。结果显示，Rg1@NCM组在MOp、MOs、SSp-ul、SSp-ll、SSs和SC之间的功能连接显著增强。这些发现表明，Rg1@NCM制剂有效促进了中风后受损的感觉运动和高级认知大脑网络的功能恢复。这些关键脑区功能连接的增强是Rg1@NCM治疗组观察到的神经和行为结果改善的基础。

图5 Rg1@NCM改善了 PT 小鼠的长期脑功能连接

Rg1@NCM中风后小胶质细胞的基因和细胞形态发生改变

为了阐明Rg1@NCM的有益效果，研究首先调查了其对小胶质细胞的影响。小胶质细胞是纳米囊泡的主要受体细胞。PT术后2小时，通过尾静脉注射NCM或Rg1@NCM。3天后，分离小胶质细胞进行RNA测序分析。与NCM治疗相比，Rg1@NCM治疗显著上调了292个基因，下调了155个基因。基因本体分析显示，与“细胞骨架组织”、“吞噬作用”、“溶酶体组织”和“ATP代谢过程”相关的生物过程显著富集。

免疫荧光染色显示，PT导致小胶质细胞分支指数和最大交叉点减少，而Rg1@NCM组与PT组以及PT+NCM组相比无显著差异，表明Rg1@NCM在PT后并未进一步激活小胶质细胞。然而，Imaris软件分析显示，PT损伤导致小胶质细胞体积和面积减少，球形指数增加。相比之下，Rg1@NCM组的小胶质细胞体积和面积显著大于PT组和PT+NCM组，球形指数进一步增加。这些发现表明Rg1@NCM可能促进小胶质细胞向吞噬形态的转变。

图6 Rg1@NCM 中风后小胶质细胞的基因和细胞形态发生改变

Rg1@NCM促进小胶质细胞吞噬中性粒细胞

研究进一步探讨了Rg1@NCM对小胶质细胞吞噬中性粒细胞的影响。RNA测序数据显示，Rg1@NCM治疗上调了与“吞噬作用”、“溶酶体组织”和“ATP代谢过程”相关的基因，表明吞噬活性增强。免疫荧光分析证实，与PT和NCM组相比，Rg1@NCM治疗组的小鼠脑实质中Ly6G+中性粒细胞数量显著减少。

为了直接评估小胶质细胞的吞噬作用，研究量化了被小胶质细胞吞噬的中性粒细胞的百分比。在PT组中，只有22%的中性粒细胞被吞噬，而Rg1@NCM治疗显著提高了这一比例至64%。此外，Rg1@NCM治疗组的CD68蛋白水平增加，CD68是激活的吞噬小胶质细胞的标志物。西方印迹分析显示，Rg1@NCM治疗组小鼠皮质中磷酸化AMPK（p-AMPK）水平显著增加，表明Rg1@NCM可能通过上调AMPK信号来增强小胶质细胞的吞噬作用，从而促进ATP产生。

图7 Rg1@NCM 促进小胶质细胞吞噬中性粒细胞

Rg1@NCM激活AMPK促进OGD/R后小胶质细胞对中性粒细胞的吞噬作用

为了进一步研究Rg1@NCM对小胶质细胞吞噬作用的影响，研究采用了体外共培养系统。模拟缺血环境后，将小胶质细胞与中性粒细胞共培养。共聚焦显微镜证实Iba1+小胶质细胞吞噬了Ly6G+中性粒细胞。Rg1@NCM处理显著增强了小胶质细胞的吞噬率。Rg1@NCM处理的小胶质细胞中Ly6G、CD68和p-AMPK蛋白水平增加，进一步支持这一发现。

为了确定AMPK激活是否对Rg1@NCM的效果至关重要，研究使用了AMPK特异性抑制剂化合物C。Seahorse分析显示，Rg1@NCM处理增加了OGD/R后小胶质细胞的基础、最大和ATP相关呼吸速率，表明线粒体功能增强。化合物C显著减弱了这些增加，表明AMPK活性对Rg1@NCM介导的能量代谢增强至关重要。成像流式细胞术和免疫荧光分析显示，化合物C抑制了Rg1@NCM诱导的小胶质细胞对中性粒细胞的吞噬增加。西方印迹分析证实，化合物C抑制了Rg1@NCM介导的小胶质细胞中Ly6G、CD68和p-AMPK的上调。这些发现证实，AMPK激活对于Rg1@NCM增强小胶质细胞能量代谢和促进中性粒细胞吞噬是必要的。

 图8 Rg1@NCM激活 AMPK 促进 OGD/R 后小胶质细胞对中性粒细胞的吞噬作用

Rg1@NCM抑制小胶质细胞的cGAS-STING通路，促进卒中后血管重塑

中性粒细胞释放的NETs通过cGAS-STING通路激活小胶质细胞的先天免疫反应和炎症因子的释放，最终阻碍血管重塑和长期功能恢复。鉴于Rg1@NCM增强了小胶质细胞清除中性粒细胞的能力，研究进一步探讨了其对NETs形成和cGAS-STING通路的影响。小胶质细胞的RNA测序分析显示，“先天免疫反应”和“炎症反应”相关基因下调。Rg1@NCM治疗显著降低了小鼠皮质组织中NETs标志物（H3Cit、MPO和NE）的蛋白水平。Rg1@NCM治疗还抑制了cGAS-STING通路关键组分的表达，包括cGAS、STING、磷酸化TBK1（p-TBK1）和磷酸化IRF3（p-IRF3）。相应地，Rg1@NCM还抑制了下游促炎细胞因子IL-6和IFN-β的产生。保持血脑屏障（BBB）的完整性对中风后恢复至关重要，而BBB的破坏通常与cGAS-STING激活相关。值得注意的是，Rg1@NCM治疗增加了受伤大脑中紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达，这些蛋白对BBB的完整性至关重要。

为了评估Rg1@NCM对血管重塑的长期影响，研究在中风后14天检查了大脑微血管。Rg1@NCM治疗显著增加了 peri-infarct皮质中的血管密度、灌注微血管（直径<6微米）长度、接触面积、体积和体积/总灌注体积比，而中风和NCM组之间没有显著差异。这些发现表明，Rg1@NCM有效地抑制了小胶质细胞中的cGAS-STING通路，可能由于其增强了中性粒细胞的清除并减少了NETs的形成，从而为血管重塑和组织修复创造了更有利的微环境，突出了Rg1@NCM在促进中风后恢复中的治疗潜力。

图9 Rg1@NCM 抑制小胶质细胞的 cGAS-STING 通路，促进卒中后血管重塑

小结

综上所述，此项研究开发的Rg1@NCM纳米递送系统为中风治疗提供了一种新的策略。通过利用中性粒细胞膜的天然靶向能力，Rg1@NCM能够有效穿透血脑屏障，增强小胶质细胞对中性粒细胞的清除，抑制炎症反应，促进血管重塑，从而显著改善中风后的脑损伤和功能恢复。这一成果不仅为中风治疗提供了新的思路，也为纳米医学在神经系统疾病中的应用开辟了新的途径。

参考文献：Hu K, Ye J, Fan P, Zheng R, Wang S, Peng Y, Ruan Y, Yan X, Zhang Z, Chu S, Chen N. Targeting and reprogramming microglial phagocytosis of neutrophils by ginsenoside Rg1 nanovesicles promotes stroke recovery. Bioact Mater. 2025 Jan 22;47:181-197. doi: 10.1016/j.bioactmat.2025.01.017. PMID: 39906647; PMCID: PMC11790502.

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