结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤。结肠癌的治疗决策主要依赖于病理分期，但传统分期系统缺乏准确性，并且可能导致患者过度治疗或治疗不足。目前，Ⅱ-Ⅲ期结肠癌的治疗通常包括手术和辅助化疗。液体活检技术已成为指导Ⅱ-Ⅲ期结肠癌患者辅助化疗（ACT）决策的一种非常有潜力的工具。已有研究表明，在手术治疗后检测ctDNA不仅可以识别复发风险高的人群，而且与较差的无病生存期（DFS）有关，辅助化疗完成后检测到的微小残留疾病（MRD）也与高复发风险和更差的DFS相关。虽然现有的ctDNA检测方法可以帮助识别结肠癌复发高危人群，但这些方法灵敏度有限，尚不足以在临床实践中实施，特别是在手术后立即需要决定ACT时，这为结肠癌患者的治疗带来了挑战。

近日，西班牙和丹麦研究团队在Nature Cancer发表文章“Whole-exome tumor-agnostic ctDNA analysis enhances minimal residual disease detection and reveals relapse mechanisms in localized colon cancer”，报道了两个独立队列中复发Ⅱ-Ⅲ期结肠癌患者不同时间点的血浆ctDNA的全外显子组测序（WES）结果，以及患者复发期间转移组织的转录组学和蛋白质组学分析结果。该研究加深了对结肠癌进展机制的理解，揭示了有效消除MRD的潜在治疗方法，有助于改善患者管理，提高ctDNA检测分析的灵敏度。

更精确和合理地检测、治疗MRD，打开了预防疾病复发的可能性。ctDNA不仅能用于检测MRD，而且比临床复发提前了几个月，强调了液体活检改变局部结肠癌治疗决策前景的潜力。但ctDNA检测MRD的灵敏度仍需进一步提高。该研究旨在通过分析基于血浆tumor-agnostic的WES是否可以提高检测MRD的灵敏度，从而超越定制panel的限制。

在前瞻性研究中，研究人员招募了320名Ⅱ-Ⅲ期结肠癌患者。发现队列中的25名复发性结肠癌患者的纵向血浆样本和组织样本（原发肿瘤）进行了WES ctDNA分析。大多数患者（18/25，72%）接受ACT治疗。验证队列包括15名复发性结肠癌患者，大多数患者（14/ 15,93%）接受ACT治疗。对基线和研究队列进行的配对血浆和肿瘤组织样本WES，重点分析了单核苷酸变异（SNV）、小片段插入和缺失（Indel）和拷贝数变异（CNV）。

图1.研究设计。

分子图谱显示，两个独立队列的所有患者在基线和复发期间均表现出至少一种通过血浆样本检测到的体细胞突变（图2a）。通过比较同一时间点的组织和血浆样本的体细胞点突变和CNV，发现队列基线血浆中检测到的所有体细胞突变与基线组织样本的一致性为26.6%；当比较在复发期间收集的血浆和组织样本时，一致性降至18.1%（图2b）。

在发现队列中，33.9%的体细胞突变仅出现在基线血浆样本中（验证队列为49%），这种突变模式在复发时持续存在，其中22.3%专属于ctDNA。一致性突变的变异等位基因频率明显高于血浆特异性突变。CNV分析显示，基线时肿瘤与血浆的一致性为95.3% ，复发时为90% （图2c），血浆拷贝数缺失在免疫信号通路中富集，而增加与增殖通路相关（图2d）。

图2.配对血浆和组织样本中分子图谱分析。

以上结果表明，血浆样本在分析肿瘤内异质性方面优于组织样本，强调了在疾病过程中血浆监测的重要性，可揭示独特的遗传特征，用于指导MRD的靶向治疗干预。

目前，采用ctDNA检测MRD主要分为两大技术路线，Tumor-informed assays（基于肿瘤组织测序的ctDNA个性化定制方案）、Tumor-agnostic assays（基于血浆检测的固定panel）。为评估基于血浆cfDNA的WES能否增强MRD敏感性检测，研究团队对结肠癌患者术后立即收集的血浆样本进行了Tumor-agnostic WES。数据显示，在86.7%（13/15）和100%（14/14）的结肠该患者中检测到至少一种体细胞突变。来自发现队列21名未复发结肠癌患者中，只有1名患者检测为ctDNA阳性，特异性为95%。

考虑临床适用性，研究人员重点分析了患者主要组织外显子组中VAF最高的16个体细胞突变。基于术后血浆样本分析，发现队列中67%的患者和验证队列中57%的患者检测到至少两种候选突变。当基于基线血浆样本分析时，发现队列的敏感性为67%，验证队列的敏感性为86%。如果将ctDNA阳性定义为血浆检测到一个突变，则发现队列中灵敏度增加到89%，验证队列灵敏度增加到100%。考虑到现有的学术和商业检测方法只要求检测血浆中的一种变异阳性，该研究的Tumor-agnostic WES方法与其他现有检测相比提高了灵敏度，同时保持了特异性。

研究团队全面了解了结肠癌患者的肿瘤演变动态，分析在肿瘤演变过程中的持续突变变化（图3b）。在复发时检测到ctDNA中的获得性变异，分别占发现和验证队列中体细胞突变的23%和26.5%。无论是否辅助化疗，部分患者复发时出现的突变在其基线血浆样本中没有。来自发现队列的原代组织的转录组反褶积显示，基线和复发血浆之间的分子相似性与活化的B细胞相关（图3c）。免疫组化（IHC）分析证实了这一发现。诊断时浸润率升高与基线-复发一致性降低有关，表明肿瘤演变更快，而浸润率低和相似性高表明演变较慢。

进一步分析表明，在发现和验证队列中，复发期间获得的体细胞突变与上皮-间质转化（EMT）途径的激活显著相关（图4d）。转录组学分析显示，携带野生型EMT基因的患者没有经历这种转变，携带突变基因的患者由于EMT途径的激活使上皮细胞转变为间质细胞。这些患者携带已知可激活EMT通路的FLNA、ITGB3、LAMC1、SLIT3和TGFBR3的高影响突变。研究表明，通过ctDNA分析可以更准确地捕获肿瘤的演变，并确定与初始B细胞浸润到原发肿瘤相关的两种演变模式，这可能有助于肿瘤细胞的免疫逃逸和随后的细胞迁移。

图3.肿瘤演变

研究团队对结肠癌患者复发时获得性体细胞突变及其相关功能进行了分析，发现肿瘤在正向进化选择的驱动下积累了许多致病突变，导致了对肿瘤进展至关重要的功能（图4）。此外，发现队列中的蛋白质组学分析显示，与相应的原发组织相比，转移组织中与抗原呈递和加工途径相关的基因的蛋白质组学水平不同。以上结果表明，复发样本中功能突变的富集优先针对特定基因，从而促进免疫逃避，最终增强复发期间的肿瘤适应性。

此外，在发现队列中，75%和80%的患者分别在基线和复发时具有临床可操作的突变，主要在RAS、PI3K-AKT-mTOR和DNA损伤修复途径中。在验证队列中也看到了类似的结果，其可用药突变中，62.5%与发现队列共享。根据MRD，发现队列中60%的患者和验证队列中71%的患者在手术后表现出潜在的可操作突变。该结果表明了开展MRD分子研究以有效根除疾病和优化患者治疗的必要性。

研究团队综合分析揭示了结肠癌复发期间ctDNA的动态变化。通过手术后立即进行ctDNA WES（仅考虑一种变体作为ctDNA阳性），显著提高了检测MRD的灵敏度，在发现和验证队列中，该方法灵敏度分别达到86.7%和100%，特异性为95%，优于目前用于检测MRD的商业分析方法。该研究确定了免疫逃避机制是局部结肠癌进展的主要驱动因素，复发时的功能突变负荷促进了这一进程，强调了基于血浆的监测和在MRD中揭示独特遗传特征的重要性。

论文原文

Martín-Arana, J., Gimeno-Valiente, F., Henriksen, T.V. et al. Whole-exome tumor-agnostic ctDNA analysis enhances minimal residual disease detection and reveals relapse mechanisms in localized colon cancer. Nat Cancer (2025). https://doi.org/10.1038/s43018-025-00960-z

Tags： Nat Cancer：基于WES的ctDNA分析可提高结肠癌MRD检测灵敏度并揭示新的复发机制