细胞外囊泡（EVs）是多种不同纳米颗粒的集合，在大小和分子组成上具有很大的异质性。EV表现出许多固有的特性，使它们成为纳米药物的输送工具。但有效地将EV用于临床治疗的方法尚未实现，临床转化有诸多障碍，其中一个关键障碍是EV内在的异质性。EV的异质性意味着单个囊泡不具有所有的化学或物理特征，即使从单个细胞产生的EV也具有成分异质性，因此无论来源的同质性如何，功能亚群都可能存在。

近日，杂志Nature nanotechnology上发表了一篇题为“Harnessing extracellular vesicle heterogeneity for diagnostic and therapeutic applications”的文章。这篇综述提出了囊泡异质性作为EV/ANV临床转化为纳米治疗的主要障碍。作者强调了解决异质性的三个基石，包括相互补充的单分子EV表征方法的实施，单个EV功能分析的标准化，以及合理利用工程EV。作者强调了一些可以作为未来发展焦点的主要挑战，包括开发基于高分辨率的分离技术，以及改进蛋白质脂质体/ANV合成的方法。解决这些瓶颈将改善基于EV的治疗方法，为ANV工程方法提供信息，并加速EV和ANV的临床转化。

图片来源：Nature nanotechnology

EV存在高度异质性的亚群

EV本质上是异质的，每个囊泡包含不同浓度和分子组合。不同来源分离的EV存在亚种群间功能差异，特定来源的EV组成也存在亚种群内差异。即使在来自单一来源的富集分离株中，EV在大约30 nm到150 nm的尺寸范围内浓度呈对数线性下降，大多数EV在40-100nm范围内。来自单一来源的不同大小的EV会表现出不同的生物学功能。

考虑到EV的异质性和表征方法的局限性，作者在改善治疗应用的背景下，提出了三个主要的基石以及相关的挑战。

基石1：实施相互补充的单分子EV的表征方法，并进行校正

解决EV异质性的第一步是准确表征特性，理想情况下是在单个EV上的单分子分辨率。现代单粒子平台包括NTA、纳米级流式细胞术（FCM）、干涉反射成像-荧光显微镜、RPS、超分辨率显微镜（SRM）、电子显微镜（EM）和单颗粒光谱学。在分子或大小灵敏度阈值方面，每种技术都有明显的优点、缺点和检测限（见下表）。

NTA测量在本质上偏向于更大的EV，RPS改进了检测限，但通常不提供分子信息。单粒子分辨率的荧光平台可以提供多路分析，但可能没有足够的表征EV的敏感性。SRM的空间分辨率优异，并可提供有关单个EV的形态、物理和化学组成的信息。然而，SRM依赖于特殊的染料和化学条件，EV必须固定。EM具有高灵敏度，但不能传递分子信息。重要的是，单粒子技术对EV子集很敏感；因此，相同EV不太可能通过不同的技术进行比较，这使得可直接比较的校正至关重要。

单粒子表征方法的比较。图片来源：Nature nanotechnology

挑战1：EV富集技术落后于EV表征技术

随着在单分子灵敏度下测量EV功能分子技术的发展，暂时还缺少基于这些信息对EV进行分类和富集的平台，这是EV治疗应用的一个主要障碍。需要更多的工作来开发这种高效、高通量、多参数EV提取的平台。对于常规的EV表征，理想的工作流程是从多个仪器中收集校准的数据，以报告一致性。在可能的情况下，EV检测的单位应转换为标准单位，不同仪器的测量值应转换为等效的标准值。

基石2：EV亚群的标准化功能分析

EV治疗的功能包括(1)高细胞摄取，(2)细胞/组织向性，(3)免疫调节，(4)内皮屏障跨越，(5)保护作用（例如神经保护），(6)再生特性（例如血管生成）和(7)细胞死亡/增殖。作者概述了一个理想的、广义的工作流程来开发一个适当的MOA研究（见下图）。

首先，为了确认给定试验中的效价来自EV，设置合理对照组。确认EV与靶细胞相互作用（共聚焦显微镜）将是有益的。分析方法应针对感兴趣的功能，并应设置阳性对照组确保测量方法可量化。将EV特性与功能关联起来的最常见的做法是使用多重分析方法，包括(1)使用多个具有不同物理化学性质的内源性EV群体，(2)去除或阻断特定的物理化学成分、敲除、敲入或突变可用于识别功能分子，(3)比较来自转基因细胞的EV和(4)将EV与合成/模拟的EV进行比较。

在单囊泡异质性背景下确定EV MOA的广义实验流程。

图片来源：Nature nanotechnology

挑战2：在临床治疗中不考虑到EV的异质性

EV的临床应用已经在顺利进行中，但异质性很少被考虑，导致严谨性和可重复性差。很少有关于EV临床试验的描述承认EV亚群。使用前一节所述的工作流程改进试验设计无疑会提高临床研究的性能、一致性和影响。

基石3：工程纳米囊泡来补充和基准EV

最后一个基石是利用合成的人工纳米囊泡（ANVs）。ANV在解决内源性EV的异质性和培养细胞的低收获率方面的应用正在上升。ANV通常使用脂质体作为基底合成，也有将脂质体和天然EV，从而产生半合成或杂交的ANV。EV模拟脂质体通常与多肽、蛋白质或其他分子一起功能化。ANVs可被用来探索关于EV大小和组成之间相互作用的问题（如下图）。ANV可以被设计用于各种EV膜和核心内容物，同时改变直径。

人工纳米囊泡（ANVs）可被用来探索EV。

图片来源：Nature nanotechnology

挑战3：ANV的异质性

ANV表征也存在与上述相同的局限性，即低散射效率和单分子灵敏度的挑战。ANV配方是一个自下而上的过程，即从空白状态开始引入纳米颗粒的理化学特征。该领域目前正在努力寻找简单而可靠地将单一蛋白质或功能引入ANV的方法。此外，目前尚不清楚目前自下而上的ANV合成方法是否能够达到模拟EV所需的复杂性，如在单个囊泡中多个不同的膜蛋白或复杂聚糖。

未来的关键里程碑

先进的囊泡表征：实现更高的分辨率和更准确的描述单个EV的特性——揭示它们真正的异质性。

标准化的功能分析：迫切需要建立标准化的分析方法来验证EV的效力和实用性。

临床试验细化：一个重要的里程碑将是在临床试验设计中广泛承认EV的异质性。这种识别可以提高EV在临床环境中的应用的重现性、再现性和安全性。

熟练运用工程ANV：成功生产与天然EV的复杂性和功能非常相似的ANV，成功引入多种蛋白质、复杂聚糖并控制它们在ANV中的空间分布将是一项关键成就。

治疗方面的应用和基准：一个重要的里程碑将是ANV的使用，不仅作为治疗药物，而且作为基准标准，在功能和特性方面进行比较。

大小和组成之间的相互作用：使用ANV来研究EV的大小和组成之间的关系，将有助于更深入地了解其自然功能和潜在的治疗应用。

用于EV和ANV分离的微流体技术：扩展和优化基于微流控的分离技术将彻底改变研究人员分离和富集特定囊泡群体的方式。

理解和模拟EV的生物发生：对特定EV亚群的生物发生途径的理解将为ANV的工程提供信息，以可靠地再现特定EV类型的特性。

解决给药挑战：解决EV给药的复杂谜题——无论是通过粒子数、蛋白质数量、特定分子或其他指标——将是至关重要的。

合作性研究和知识共享：建立和完善全球合作和标准化的平台，将确保世界各地的研究人员能够在彼此工作的基础上相互发展，为该领域的加速突破提供机会。

总结

这篇综述简要地提出了一种策略性地克服囊泡异质性作为EV/ANV临床转化为纳米治疗的主要障碍的前进道路。EV制剂的亚群内异质性可以解释目前基于EV的药物传递系统的缺乏疗效。亚群产生的脱靶效应可能会削弱它们的潜在影响。作者强调了解决异质性的三个具体基石，包括相互补充的单分子EV方法的实施，单个EV功能分析的标准化，以及合理利用工程EV。

作者强调了一些可以作为未来发展焦点的主要挑战，包括开发基于高分辨率的分离技术，以及改进蛋白质脂质体/ANV合成的方法。微流控平台很有希望，但到目前为止还没有实现足够的吞吐量来分离下游功能分析或体内使用所需的产量。解决这些瓶颈将改善基于EV的治疗方法，为ANV工程方法提供信息，并加速EV和ANV的临床转化。

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Tags： IVD前沿丨细胞外囊泡临床转化的挑战——异质性