随着生命科学在解析基因组复杂性以变革医学和农业方面取得进展，开发精确的染色体编辑技术对于克服遗传操作、疾病治疗和作物改良中的挑战变得至关重要。下一代基因组编辑工具必须能够实现染色体水平的修饰。在过去的几十年中，基因组编辑技术经历了从最初的简单切割到如今的高精度、可编程操作的革命性演变。现有基因组编辑进展主要聚焦于小片段DNA的修饰，而非大片段DNA编辑。传统的大片段DNA修饰方法依赖于双链断裂（DSB）和非同源末端连接（NHEJ），这可能会引入非预期的插入和缺失，并可能造成细胞损伤。

近年来，不依赖DSB的技术也已经出现，如配对pegRNA引物编辑、重组酶-CRISPR整合系统等可实现大片段DNA编辑。但这些技术仍面临效率低下、编辑规模有限以及残留不需要的重组位点“疤痕”等挑战。因此，目前亟需能够实现高效、无疤痕大片段DNA编辑的精确工具。

近日，中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞团队开发了两种新型染色体水平大片段DNA精准操纵技术，统称为可编程染色体工程（PCE）系统。经应用验证，该系统在高等生物（尤其是植物）中实现了无疤痕、从千碱基（kb）到兆碱基（Mb）级别的多种类型精准DNA操作，成功突破了基因组编辑的“尺度困境”，为生命科学研究和农业生物技术应用开辟了全新的可能性。相关研究以“Iterative recombinase technologies for efficient and precise genome engineering across kilobase to megabase scales”为题发表在Cell上。

Cre-Lox系统是一种广泛应用的位点特异性重组酶系统，其由Cre重组酶和特定的Lox位点组成。Cre重组酶能够识别并切割Lox位点，形成DNA双链断裂，随后进行重组反应，在精准染色体操作领域展现出巨大潜力。但该系统面临三大关键技术瓶颈，限制了在大规模染色体编辑中的应用，尤其是在需要高精度、高效率和稳定编辑结果的医学和农业领域。

首先，Lox位点的对称结构使得重组反应具有可逆性，这意味着已经发生的重组可能会被逆转，导致编辑结果不稳定且效率低下；其次，Cre重组酶是一种结构复杂四聚体，难以通过常规的蛋白质工程方法进行改造，这限制了Cre重组酶活性的优化提升；最后，重组后残留的Lox位点（即 "疤痕"）可能会干扰附近基因的表达，或者在后续的重组反应中被再次识别，严重影响了编辑的精确性及基因组完整性。

面对上述挑战，研究团队进行了系统性的技术攻关，逐一突破了传统技术瓶颈，实现了染色体水平的精准编辑。

PCE系统的开发和精准染色体编辑

1.高通量重组位点改造平台与不对称Lox位点改造

研究团队首先构建了一个用于快速重组位点修饰的高通量平台，并创新性地提出了不对称Lox位点设计理念：通过对Lox位点进行系统改造来破坏其对称性，使得重组反应主要朝一个方向进行，降低可逆性并显著提升编辑的稳定性。研究团队成功开发出多种新型Lox变体组合，经筛选与比较，发现其中表现最优异是Acm8组合（由Lox71和LoxAR2组成），能够将可逆重组活性降低10倍以上，接近阴性对照的背景水平，同时保持了高效的正向重组能力。

这一设计从根本上解决了Cre-Lox系统长期存在的反应可逆性问题，为精准编辑提供了稳定的技术基础。

2.利用AiCErec进行重组酶优化

接下来，针对Cre重组酶效率较低这一问题，研究团队利用基于自主开发新型AI蛋白质工程计算模拟模型AiCE，对Cre重组酶进行性能优化。

AiCE是一种整合了通用逆折叠模型、结构和进化约束信息的蛋白质定向进化系统，无需训练专属AI模型，即可实现蛋白质高效进化模拟和功能设计。基于该模型，研究团队开发了AiCErec重组酶工程化方法，能够对Cre重组酶的多聚化界面进行精准设计和优化，克服了传统方法在改造四聚体蛋白时面临的困难。

经过多轮筛选与改造，研究团队获得了一个工程化Cre变体（cm24变体），其重组效率达到野生型Cre的3.5倍，显著提升了编辑效率，为大规模染色体操作提供了更强大的工具支持。

3.Re-pegRNA：重组酶的无痕编辑策略

为解决重组后残留Lox位点的问题，研究团队开发并完善了重组酶的无痕编辑策略Re-pegRNA。该方法利用prime编辑器的高效编辑特性，通过特殊设计的pegRNA（向导 RNA），对重组后残留的Lox位点进行 "重引导编辑"，将其精准替换为原始基因组序列，从而实现完美、无痕的基因组编辑。

这一策略创新彻底解决了传统方法中编辑位点残留外源序列的难题，能够在不引入新的双链断裂的情况下，精确地修复基因组序列，使基因组编辑的精确性达到了新的高度。

通过整合上述三项技术突破，研究团队构建了PCE与RePCE两个可编程染色体编辑系统，可对不同Lox位点的插入位置和方向进行灵活编程，实现从kb到Mb尺度的大片段DNA精准无痕操作。

PCE系统是基于上述三项技术的核心系统，能够在动植物细胞中实现多种类型的染色体编辑，包括插入、删除、替换、倒位和易位等。该系统通过编程Lox位点的位置和方向，能够精确控制重组反应的类型和结果。RePCE系统是在PCE系统基础上进一步优化的系统，整合了Re-pegRNA无痕编辑策略，能够在完成重组后自动修复残留的Lox位点，实现完全无痕的染色体编辑。

研究团队还评估了PCE、RePCE系统在动植物细胞等实际应用中的性能。在水稻细胞中，PCE系统靶向整合了高达18.8 kb的大DNA片段，完全替换了5 kb DNA序列，实现了12 Mb的染色体倒位、4 Mb的染色体缺失和整条染色体易位，效率达26.2%。在人类疾病HEK293T细胞中，RePCE系统实现了与非小细胞肺癌相关位点上一个12 Mb的倒位，无疤痕编辑的成功率高达90%。

特别地，作为概念验证，研究团队还利用PCE系统在水稻细胞中精准倒转了315 kb的DNA片段，成功培育出具有抗除草剂的水稻种质，展示了其在基因工程和作物改良方面的变革潜力。

综上所述，研究团队开发了无疤痕染色体编辑系统，能够在植物和人类细胞中高效进行大规模DNA操作，应用范围从千碱基到兆碱基级别。这项开创性研究不仅克服了Cre-Lox系统的历史局限性，而且还为各种生物体的精确基因组工程开辟了新途径。

参考资料：

https://www.sciencedaily.com/releases/2025/08/250805041612.htm

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