摘 要

目的  通过对精神分裂症伴与不伴社交焦虑障碍患者进行代谢组学测序分析，寻找精神分裂症患者社交焦虑障碍的代谢标志物。

方法  在2022年12月至2023年12月于福州市第二总医院神经精神病防治院开展病例对照研究，纳入精神分裂症患者160例，通过《精神疾病诊断与统计手册第四版》（The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, fourth edition，DSM-Ⅳ）与利博维茨社交焦虑量表（Liebowitz social anxiety scale，LSAS）得分将患者分为伴社交焦虑障碍组（n=64）和不伴社交焦虑障碍组（n=96）。收集两组患者的外周血样本进行非靶向代谢组学测序，并对其中有统计学差异的代谢物进行受试者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析，寻找可能影响精神分裂症患者社交焦虑障碍的代谢标志物。

结果  两组患者间12种代谢物存在统计学差异（P<0.05）。ROC曲线分析中曲线下面积（area under curve，AUC）较大的3种代谢产物分别为3-O-反式-对香豆酰-阿尔菲托酸（AUC=0.637）、3-巯基丙酸（AUC=0.602）、壬-2-酰基肉碱（AUC=0.600）。

结论  3-O-反式-对香豆酰-阿尔菲托酸、3-巯基丙酸、壬-2-酰基肉碱作为诊断代谢标志物可以有效地区分精神分裂症社交焦虑障碍患者与精神分裂症非社交焦虑障碍患者。

关键词 

社交焦虑障碍；精神分裂症；LC-MS；非靶向代谢组学；差异代谢物；ROC曲线；诊断标志物

社交焦虑障碍是对社交情境产生大量恐惧的焦虑障碍，患者会因为社交情境产生巨大的痛苦，且导致某部分的日常生活功能障碍。研究显示精神分裂症患者的社交焦虑症状患病率为32.8%，相较于常规人群社交焦虑症的患病率明显增高^[1]。目前对其病理生理机制认识有限。代谢组学研究是通过研究患者体液中代谢物含量与合成通路，识别患者疾病的代谢水平变化与揭示代谢途径的改变，进而寻找疾病的潜在诊断标志物^[2]。然而目前对精神分裂症伴社交焦虑障碍的代谢组学研究较缺乏。因此，本研究通过分析精神分裂症患者社交焦虑障碍的差异代谢物，探寻可能影响疾病发生的诊断代谢标志物。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2022年12月至2023年12月在福州市第二总医院神经精神病防治院收治的住院精神分裂症患者作为研究对象。纳入标准：①符合《国际疾病与相关健康问题统计分类第10版》（International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems, 10th version, ICD-10）精神分裂症的诊断标准；②由2位精神科主治医师及以上职称医师诊断；③伴社交焦虑障碍组符合《精神障碍诊断与统计手册第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth Edition, DSM-Ⅳ）中社交焦虑障碍的诊断标准且利博维茨社交焦虑量表（Liebowitz social anxiety scale，LSAS）得分≥38分^[3]，不伴社交焦虑障碍组不符合DSM-Ⅳ中社交焦虑障碍的诊断标准且LSAS得分<38分。排除标准：①患阿尔茨海默病、帕金森病及智力发育迟滞等神经系统疾病或有脑外伤；②存在严重肝肾功能不全、心功能不全等躯体疾患；③精神活性物质滥用者；④入组前30 d内接受过静脉输注血制品者。

本研究通过福建省立医院伦理审查委员会审议并获得批准[审批号：（2021-09）第（48）号]。入组患者本人和（或）家属（监护人）签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 资料收集与量表评估 收集研究对象的基本信息，包括年龄、性别、既往病史、住院时间等。由2位精神科主治医师及1位流行病学调查员采用LSAS评定研究对象社交焦虑障碍情况。LSAS通过测量患者社会交互行为和社交表现中的恐惧情绪和回避行为，来有效评估社交焦虑障碍水平，该量表分值越高，提示患者社交焦虑障碍情况越严重。

1.2.2 液相色谱-质谱（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）非靶向代谢组学测序 研究对象抽取静脉血5 mL于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，于4 ℃、3000×g离心10 min，取上层血浆置于-80 ℃冻存。检测前取100 μL血浆加入300 μL冰冷乙腈中，在25 ℃下涡旋10 min，然后于-20 ℃静置1 h。之后将混合液于4 ℃、14000×g离心15 min，并取上清液作为实验样本进行LC-MS分析，同时在每个样本中吸取等量液体混匀作为内部质量控制（quality control，QC）组纳入LC-MS分析。

LC-MS色谱条件：色谱柱的正离子模式采用Acquity UPLC BEH C8柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm，美国Waters公司）；负离子模式采用Acquity UPLC HSS T3柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm，美国Waters公司）；流动相A相为0.1%甲酸/水；流动相B相为0.1%甲酸/乙腈。梯度洗脱程序：0~1 min，5%B；1.1~11 min，5%~100%B；11.1~13 min，100%B；13.1~15 min，5%B。其中流速为0.35 mL/min，柱温为50 ℃，进样体积为5 μL。

LC-MS质谱条件：采用加热电喷雾离子源，正离子模式喷雾电压设置为3.8 kV；负离子模式喷雾电压设置为-3.0 kV，毛细管温度为320 ℃，辅助气加热温度为350 ℃，辅助气流速为8自由单位，鞘气流速为35自由单位，S-Lens的射频等级50，采用一级全扫描和数据依赖型二级子离子扫描模式，每次全扫描后采集最强的5个碎片图谱进行二级质谱扫描。母离子扫描范围为70~1050 m/z，一级质谱的分辨率为70000半峰宽（full width at half maxima，FWHM），二级质谱的分辨率为1750 FWHM，NCE/stepped NCE碰撞能量为20 eV、40 eV。

1.3 统计学方法

使用SPSS 25.0对基本资料进行统计分析。基本资料组间比较使用Mann-Whitney U检验或χ²检验。使用主成分分析（principal components analysis，PCA）得分、偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）得分和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）得分量化伴社交焦虑障碍组与不伴社交焦虑障碍组整体代谢产物种类的差异。使用OPLS-DA中获得的变量重要性（variable importance in projection，VIP）值来量化伴社交焦虑障碍组与不伴社交焦虑障碍组差异代谢产物的重要情况，VIP>1.0且组间比较有统计学差异（P<0.05）的代谢产物为显著变量。使用“pROC”R软件包（the R Foundation；版本4.1.0）绘制受试者操作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲线，并评估相关潜在标志代谢产物区分精神分裂症患者伴与不伴社交焦虑障碍的敏感性和特异性。

2 结果

2.1 人口学特征及临床资料

收集160例精神分裂症患者，其中伴社交焦虑障碍组64例患者，不伴社交焦虑障碍组96例患者。两组间年龄（Z=0.513，P=0.732）、性别（χ²=0.095，P=0.758）、住院时间（Z=-1.112，P=0.379）无统计学差异。见表1。

表1   两组人口学特征及临床资料Tab.1   Demographic characteristics and clinical data of the two groups

2.2 PCA分析结果

PCA分析结果显示正负离子模式下，QC组得分值离原点较近，这说明数据采集过程中设备及实验条件稳定，所得数据准确可靠。正负离子模式下两组得分分布椭圆相距较近但并无完全重叠情况，即表明两组样本代谢物整体存在些许差异，存在差异的代谢物较少。正离子模式下第一主成分解释度为47.10%，第二主成分解释度为8.42%；负离子模式下第一主成分解释度为45.80%，第二主成分解释度为8.64%（图1）。

图1   PCA分析得分 A.正离子模式下；B.负离子模式下。PC1为第一主成分解释度，PC2为第二主成分解释度。Fig.1   PCA analysis score chart

2.3 PLS-DA分析结果

PLS-DA分析显示正负离子模式中两组间整体得分椭圆模型存在分离，即表明两组间存在差异代谢物（图2）。正离子模式下第一主成分的解释度为38.5%，第二主成分的解释度为17.2%；负离子模式下第一主成分的解释度为35.3%，第二主成分的解释度为20.2%。PLS-DA模型验证结果显示，正负离子模式下R2均在Q2以上，说明模型拟合良好，可预测性强，适合后续数据分析（图3）。

图2   PLS-DA得分图 　A. 正离子模式下；B. 负离子模式下。Component 1为第一主成分解释度，Component 2为第二主成分解释度。Fig.2   PLS-DA score chart

图3   PLS-DA模型验证图 　A. 正离子模式下PLS-DA模型验证图；B. 负离子模式下PLS-DA模型验证图。Fig.3   PLS-DA model verification diagram

2.4 OPLS-DA分析结果

OPLS-DA分析显示正负离子模式中两组间整体得分椭圆模型存在分离，即表明两组间存在差异代谢物（图4）。正离子模式下第一正交成分解释度为52.80%；负离子模式下第一正交成分解释度为51.40%。OPLS-DA模型验证结果显示，正离子模式下R2在Q2以下，负离子模式下R2在Q2以上，说明模型拟合良好，可预测性强，适合后续数据分析（图5）。

图4   OPLS-DA得分图 　A. 正离子模式下；B. 负离子模式下。Component1为第一预测主成分解释度，Orthogonal Component1为第一正交成分解释度。Fig.4   OPLS-DA score chart

图5   OPLS-DA模型置换检验图 　A. 正离子模式下；B. 负离子模式下。Fig.5   OPLS-DA model replacement test diagram

2.5 VIP值筛选差异代谢物结果

本研究差异火山图中差异倍数（fold change，FC）表示伴社交焦虑障碍组与不伴社交焦虑障碍组代谢物浓度的差异倍数。该值为正时，表示差异上调；该值为负时，表示差异下调。图6可见12种差异代谢物存在明显组间差异且均为下调，表明差异代谢物在伴社交焦虑障碍组的浓度明显小于不伴社交焦虑障碍组。组间比较结合OPLS-DA中的VIP值筛选结果显示该12种血浆代谢物在OPLS-DA模型中为两组之间差异代谢产物（即P<0.05且VIP>1），其中考虑到喹硫平为患者日常用药，因此本研究针对除喹硫平外11种差异代谢物进行研究，见表2。

图6   代谢物差异火山图Fig.6   Volcanic map of metabolite differences

表2   两组差异代谢物详细信息表Tab.2   Two groups of different metabolites detailed information table

2.6 ROC曲线分析 ROC分析结果显示，AUC较大的3种差异代谢物分别为3-O-反式-对香豆酰-阿尔菲托酸（AUC=0.637，灵敏度为0.76，特异度为0.52）、3-巯基丙酸（AUC=0.602，灵敏度为0.53，特异度为0.71）、壬-2-酰基肉碱（AUC=0.600，灵敏度为0.59，特异度为0.62）（图7）。

图7   ROC曲线分析结果图 　A、B、C分别为3-O-反式-对香豆酰-阿尔菲托酸、3-巯基丙酸、壬-2-酰基肉碱的分析结果。曲线上的点是基于ROC曲线确定的区分两类的最佳阈值。Fig.7   ROC curve analysis results

3 讨论

气相色谱（gas chromatography，GC）和液相色谱（liquid chromatography，LC）被广泛用于代谢组学分析。GC具有较高的重现性和稳定性，因此通常用于分析挥发性有机化合物、脂质和小分子化合物^[4]。然而，GC在分析非挥发性化合物以及大分子或热不稳定的化合物方面存在局限性^[5]。相比气相色谱-质谱（gas chromatography -mass spectrometer，GC-MS），LC-MS对非挥发性化合物和大分子或热不稳定化合物具有更多优势，使其成为代谢组学研究中最全面的方法^[6]。同时，非靶向代谢组学能在不依赖预先指定类别的情况下分析所有可检测的代谢物，可以识别疾病的潜在生物标志物^[7]。

3-O-反式-对香豆酰-阿尔菲托酸（3-O-trans-p-coumaroyl-alphitolic acid，3OTPCA）是三萜类化合物的一种。萜类化合物是最大的一类天然产物，存在于生物体中参与机体能量代谢、生物信号转导^[8]。萜类化合物分为3类：倍半萜类、二萜类和三萜类^[9]。在自然界中已发现超过20 000种三萜类化合物^[10]。研究发现许多三萜类化合物对许多疾病有益^[10-11]。关于3OTPCA，研究发现其能使恶性肿瘤细胞发生细胞凋亡^[12-13]，但具体机制不明。探寻3OTPCA使恶性肿瘤细胞凋亡机制的研究，用3OTPCA处理U937细胞中的磷脂酰丝氨酸外化和caspase-3裂解，发现3OTPCA会导致显著的DNA碎片化、膜联蛋白-V结合和caspase-3裂解，这表明3OTPCA通过诱导细胞凋亡发挥细胞毒性作用^[14]。目前对于3OTPCA与精神疾病之间的关联研究较少，主流的3OTPCA研究主要是促进恶性肿瘤细胞凋亡的机制研究。

3-巯基丙酸属于丙酸门类，是一种有机硫化合物，分子中有巯基和羧基。3-巯基丙酸因其含有巯基羧基，常常和巯基活性基团共同参与机体的多种细胞代谢活动^[15]。QI等^[16]的研究显示，丙酸门类化合物的受体能够增强突触功能，改善精神分裂症模型小鼠的认知功能障碍，同时也能够增加小鼠海马组织中脑源性神经营养因子的蛋白质水平。

壬-2-酰基肉碱是肉碱与脂肪酸或氨基酸代谢物结合的一种酯类物质，在许多生物过程中发挥重要作用，如脂肪酸的b-氧化代谢。一项针对健康小鼠的动物研究表明^[17]，长期摄入乙酰-L-肉碱会改变大脑能量代谢，增加去甲肾上腺素和血清素的含量。此外，越来越多证据表明，机体肉碱含量降低可能导致精神疾病，包括抑郁症^[18]、孤独症谱系障碍^[19]和精神分裂症^[20]。同时有研究显示酰基肉碱系化合物水平的改变会引起机体代谢紊乱^[21]。

本研究创新之处在于，通过LC-MS高通量技术结合生物信息分析寻找影响精神分裂症患者社交焦虑障碍的代谢标志物。本研究不足之处：首先，本研究未将社交焦虑障碍患者区分亚型，在后续研究中可针对亚型进行细致区分，从而更深入进行研究；其次，本研究为横断面研究，对了解疾病发展、疾病治疗与诊断代谢标志物含量的相互作用有限制。今后研究可在不同时期对患者进行随访，观察不同时期精神分裂症伴社交焦虑障碍患者代谢物的变化情况，并探讨疾病病程及不同治疗方法对精神分裂症伴焦虑障碍患者代谢物水平的影响。

综上，本研究发现，精神分裂症患者是否伴有社交焦虑障碍其代谢物水平存在显著差异。LC-MS非靶向代谢组学分析显示两组患者存在12种差异代谢物，ROC曲线分析发现3-O-反式-对香豆酰-阿尔菲托酸、3-巯基丙酸、壬-2-酰基肉碱在区分精神分裂症伴与不伴社交焦虑障碍患者中，具有良好的AUC值、灵敏度以及特异度，可以作为识别精神分裂症患者是否伴有社交焦虑障碍的潜在诊断代谢标志物。

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【Cite this article】WU Y S,FANG Y Y,WANG L ,et al.A metabolome-wide case-control study of social anxiety disorder in patients with schizophrenia[J]. Chin J Nervous Mental Dis，2024，50(10）：592-598.

DOI：10.3969/j.issn.1002-0152.2024.010.004

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