以腺相关病毒(AAV)为载体的基因治疗近年来已有一系列突破性药物获批上市^[1]，但当前这些疗法主要应用于遗传性罕见病领域。AAV技术难以用于心肌梗死等常见疾病的治疗，这主要受限于其自身的技术缺陷。其中，AAV介导的基因表达难以在时间、空间和表达水平上进行精细调控，是未来扩大AAV基因治疗适应症范围、实现更精准的AAV基因治疗的关键障碍。

以心肌梗死为代表的缺血性心脏病，是全球范围内的首要死因。尽管基础研究已发现大量具有促心肌再生潜力的基因，但由于缺乏可靠的基因治疗调控技术支持，这些策略难以在保障安全性的前提下实现有效的心肌再生，因而难以推进至临床阶段。因此，开发适用于基因治疗临床应用的基因表达调控技术，有望为发展一系列全新形态的基因治疗药物突破关键障碍。

2025年6月13日，北京大学基础医学院、北京大学心血管研究所、血管稳态与重构全国重点实验室郭宇轩/董尔丹研究员团队在Nature Cardiovascular Research杂志上发表题为“The drug-elicitable alternative splicing module for tunable vector expression in the heart”的研究论文^[2]。该研究基于FDA批准的小分子可变剪接调节剂^[3]，开发了具有自主知识产权的AAV基因表达调控技术DreAM (Drug-elicitable alternative splicing module)。该团队利用DreAM技术在小鼠心梗模型中精细控制心肌再生的时间、程度和部位，有效避免了AAV表达失控导致的心源性猝死和肝癌风险。 

1. DreAM技术的开发

AAV基因表达无法从表达时间、空间和程度三方面进行精细地调控，极大限制了AAV基因治疗的临床转化。为了解决这一技术瓶颈，本研究团队自主研发了调控AAV基因表达的DreAM技术，技术原理如下图。

图1. DreAM技术原理图。

DreAM为一段含有[外显子1-内含子-假外显子-内含子-外显子2]的核酸序列，其中假外显子受Risdiplam调控且包含唯一的蛋白翻译起始位点ATG。在正常状态下，细胞将假外显子视为内含子，外显子1和外显子2通过mRNA剪接直接相连，产生不含ATG的非编码RNA，不能起始下游基因表达。在Risdiplam处理后，细胞将假外显子视为外显子，通过mRNA剪接形成包含假外显子和ATG的编码RNA，诱发下游基因表达。

具体开发流程：作者团队选择利用FDA批准的小分子药物Risdiplam作为基因表达调控分子，其作用原理是诱导含有特定核酸序列的RNA片段(假外显子，PSE)发生选择性剪接，从内含子变成外显子。作者首先用Risdiplam处理小鼠48小时后取心脏进行RNA-Seq的差异剪接分析，筛选了7个可被Risdiplam诱导RNA剪接变化的候选元件(图2a-c)。

作者对上述7个候选基因进行如下改造：(1) 保留RNA剪接过程中的三个关键剪接位点：5 '剪接位点(5’SS)、3'剪接位点(3'SS)以及位于3'SS上游18-40nt的分支位点(Branch points, BP)，删除其余部分。(2) 删除所有外显子中的起始密码子(ATG)，仅保留Risdiplam激活的假外显子序列中的一个ATG。基于此设计的调控元件能通过响应Risdiplam保留包含ATG的假外显子，控制蛋白质的翻译起始(图2d)。基于以上7个元件，作者构建了GFP报告基因质粒，在细胞中进行检测，筛选在Risdiplam作用下，基因调控倍数最高的元件。通过此方式，作者获得了来自Zfr基因的元件，称作DreAM (图2e-f, DreAM全称Drug-elicitable Alternative-splicing Module, 即药物诱发的可变剪接模块)。

图2. DreAM技术的开发

2. AAV-DreAM载体的体内验证

作者对DreAM是否在体内能对AAV基因进行精细调控进行评估。该研究团队包装了AAV-CMV-DreAM-GFP载体，对出生后1天(P1)小鼠皮下注射AAV，7天后注射一次Risdiplam (图3a)后，从动力学和量效关系两方面检测AAV-DreAM系统在体内调控AAV基因表达的特征。

结果显示，在动力学方面，DreAM调控AAV基因表达的时间具有2-3天的分辨率(图3b)。在量效关系方面，作者发现AAV-DreAM基因表达与Risdiplam的剂量正相关，并且其性质存在器官差异，DreAM在心脏和骨骼肌中具有良好的基因表达量调控幅度(图3c-d)。

接下来，作者以心脏特异性启动子Tnnt2驱动AAV基因表达，包装了新的载体: AAV-Tnnt2-DreAM-Luciferase。作者向成年小鼠体内注射AAV后，在不同时间点反复多次给予Risdiplam并进行活体成像检测Luciferase活性(图3e)。结果显示，Risdiplam可多次调控AAV-DreAM开关驱动基因表达(图3f-g)，表明DreAM技术可反复、灵活地进行基因表达调控。

图3. DreAM元件的动态响应

另外，作者还发现AAV9-Tnnt2-DreAM载体驱动的基因表达存在肝脏泄漏(图3f箭头所示)，可能是由于AAV和Risdiplam在肝脏中富集程度超过心脏导致的。为了解决这一问题，一方面，申请人基于前期已发表的工作^[4]，向AAV转基因的3’UTR引入miR122TS，降低了肝脏靶向性(图4a)。另一方面，作者也更换AAV衣壳，用对心脏亲和性更高、肝脏脱靶的MyoAAV衣壳^[5]进行AAV-DreAM的载体包装(图4d)。结果显示，以上两种方式均能提高心脏AAV基因表达的组织特异性，降低肝脏靶向性(图4b-c和e-f)。

图4. 消除DreAM元件的肝脏泄漏

3. AAV-DreAM调控YAP5SA表达控制心肌细胞增殖

过表达YAP^5SA能促进心肌细胞增殖，是心脏再生治疗的潜在手段^[6]。然而，YAP^5SA的长时程过表达会导致心肌细胞过度增殖、心室壁增厚及心源性猝死^[7]。因此，作者进一步探究了DreAM元件能否有效调控YAP^5SA的表达时间，以避免其长期过表达引发的不良事件(如心源性猝死)。作者构建了AAV-Tnnt2-DreAM-YAP^5SA载体，将其递送至P1小鼠体内。7天后，对小鼠进行Risdiplam灌胃给药(每日一次，连续四天)，随后检测YAP^5SA基因表达并评估DreAM对AAV-YAP^5SA生物学效应的影响(图5a)。结果显示，DreAM元件能有效响应Risdiplam，调控细胞核内YAP^5SA的表达(图5b-d)。在无Risdiplam激活的情况下，DreAM元件可有效防止因YAP^5SA过表达导致的小鼠死亡(图5e)。而在Risdiplam激活DreAM元件时，其调控的心脏YAP^5SA表达增强，表现为小鼠心脏收缩功能改善、心室壁增厚、心室腔缩小(图5f-g)。同时，心肌细胞横截面积减小，表达增殖标志物Ki67的心肌细胞数量增多(图5h-i)。这些结果表明，DreAM元件能有效调控YAP^5SA在小鼠心脏组织中的表达时长及其介导的心肌细胞增殖程度。

图5. DreAM元件调控心肌细胞增殖

4. AAV-DreAM-YAP5SA载体治疗小鼠心肌梗死的有效性

最后，作者团队研究了DreAM元件用于治疗小鼠心肌梗死的有效性。作者首先向心梗后3天的小鼠体内递送了AAV-YAP^5SA载体(PC组)，发现该载体能部分恢复小鼠心脏收缩功能，使心室壁增厚，但在心肌梗死17-20天时小鼠全部死亡(图6a-b)。这证实了YAP^5SA长时程过表达治疗心肌梗死的副作用。接下来，作者向心梗后3天的小鼠体内递送包含DreAM元件的AAV-YAP^5SA载体，控制该载体仅表达3-4天。在此条件下，作者发现DreAM调控的YAP^5SA瞬时表达使小鼠心功能明显恢复，心脏纤维化面积减少，并且能有效避免小鼠死亡(图6c-f)。以上结果证实了AAV-DreAM-YAP^5SA载体对小鼠心梗表型具有缓解能力，并且该治疗策略不会造成心肌细胞过度增殖和小鼠死亡。

图6. DreAM元件调控YAP^5SA表达治疗小鼠心肌梗死

然而，AAV9和YAP可能导致肝损伤和肝脏肿瘤的发生，AAV9-DreAM-YAP^5SA载体的肝脏泄漏表达存在安全性隐患。为了解决这一问题，作者将DreAM整合至心肌细胞特异性、肝脏去靶向的AAV9-Tnnt2-miR122TS载体中，对Risdiplam激活YAP^5SA表达4个月后的小鼠肝脏进行评估(图7a)，发现递送AAV9-DreAM-YAP^5SA的小鼠(6/6)出现明显的肿瘤病变，引入miR122TS有效降低了肝脏肿瘤的发生(0/6)，也降低了肝脏肿瘤生物标志物的表达(图7b-c)。重要的是，miR122TS不影响AAV9-DreAM-YAP^5SA对心肌细胞增殖的影响(图7d-e)。因此，基于miR122TS的肝脏去靶向性可降低YAP诱导的肝脏肿瘤发生的风险，同时保持AAV-DreAM在心脏中的受益作用。

图7. MiR122TS降低AAV-DreAM-YAP^5SA诱发肝脏肿瘤的风险

综上所述，本研究利用FDA批准的RNA剪接诱导剂Risdiplam，开发了基因开关元件DreAM，实现了对心脏组织中AAV介导的基因表达在时间、空间和表达水平上的精细调控。DreAM技术未来有潜力改变AAV在基础和转化研究中的现有应用模式，实现原有技术难以企及的新型基因治疗策略。

图8. DreAM元件调控YAP^5SA表达实现细胞增殖模式图

北京大学血管稳态与重构全国重点实验室PI郭宇轩研究员和董尔丹研究员为共同通讯作者。北京大学基础医学院博士研究生陈展、杨璐梓为共同第一作者。该研究获得了北京大学基础医学院赵东宇教授、张岩教授、郑乐民教授、周菁教授和北京大学药学院的苗蕾教授、陈卫老师的大力支持。波士顿儿童医院William T. Pu教授、贝勒医学院James F. Martin教授和孟凡森博士、首都医科大学附属安贞医院高霏教授、四川大学华西第二医院李一飞教授为本研究提供了重要帮助。该研究获得“四大慢病”重大专项、北京市自然科学基金“非共识”创新项目和北京基驭医疗科技有限公司的大力资助。

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[7] Yue P, Zhang Y, Liu L, Zhou K, Xia S, Peng M, Yan H, Tang X, Chen Z, Zhang D, Guo J, Pu W T, Guo Y, Hua Y, Li Y. Yap1 modulates cardiomyocyte hypertrophy via impaired mitochondrial biogenesis in response to chronic mechanical stress overload. Theranostics, 2022, 12(16): 7009-7031.

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s44161-025-00665-7

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